1.一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备检测线包被大肠杆菌O157:H7抗体、质控线包被羊抗鼠IgG抗体的试纸条;
(2)在试纸条检测区域下方放置磁铁;
(3)脂质体的制备:采用反相蒸发法制备负载辣根过氧化物酶的脂质体,将 300μL
10mg/mL 的 L‑α‑磷脂酰胆碱溶液与80μL3mg/mL 的结合生物素的磷酸乙醇胺溶液和 50μL
4mg/mL 的胆固醇溶液充分搅拌混合,减压蒸馏以除去氯仿;然后,加入100μL 100μg/mL 的 HRP 溶液涡旋混合 2 分钟;最后,经14 kDa 透析袋透析得到所需的脂质体;脂质体直径为
30‑100nm;
(4)金磁纳米颗粒Fe3O4@AuNPs表面修饰大肠杆菌O157:H7抗体,将样品溶液与修饰大肠杆菌O157:H7抗体的金磁纳米颗粒Fe3O4@AuNPs溶液、脂质体和亲和素溶液充分混合,室温下反应,滴加到样品垫上时,样品在毛细作用下在试纸条上流动,当移动到结合垫时,基于抗原抗体间的免疫反应,修饰抗体脂质体‑Fe3O4@AuNPs将与样品中含有的大肠杆菌 O157:H7 结合,形成脂质体‑Fe3O4@AuNPs‑抗体‑目标菌复合物;层析后,加入3,3',5,5'‑四甲基联苯胺和过氧化氢溶液,利用TMB‑HRP间的催化氧化反应产生大量蓝色信号增强检测信号,检测出样品中低浓度的大肠杆菌 O157:H7;
还包括将样品富集预处理:将修饰大肠杆菌O157:H7抗体的Fe3O4@AuNPs纳米颗粒溶液加入到样品溶液中充分反应,富集样品中存在的大肠杆菌O157:H7,然后在外加磁场条件下,分离出结合大肠杆菌O157:H7的免疫磁性纳米颗粒,重新溶解在PBS溶液中。
2.根据权利要求1所述的一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法,其特征在于,所述的磁铁的磁场强度为100mT‑500mT。
3.根据权利要求1所述的一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法,其特征在于,所述的试纸条包括衬板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸,所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸由后到前依次粘贴吸附在所述衬板上,所述硝酸纤维素膜上划有一条检测线和一条质控线;所述检测线包被大肠杆菌O157:H7抗体;所述质控线包被羊抗鼠IgG抗体。
4.根据权利要求3所述的一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法,其特征在于,试纸条的制备方法包括以下步骤:
(1)金磁纳米颗粒的制备:合成磁性纳米颗粒Fe3O4,在其表面包被金壳,得到Fe3O4@AuNPs纳米颗粒,在Fe3O4@AuNPs表面修饰大肠杆菌O157:H7抗体;
(2)硝基纤维膜的处理:将大肠杆菌O157:H7抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测线,将羊抗鼠IgG抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测质控线,烘干,即得到处理后的硝基纤维膜;
(3)试纸条的组装:在衬板上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜,再在酸纤维素膜的一侧搭接吸水纸,组装后裁剪为60mm长,3.8mm宽的试纸条,即得到所述定量检测大肠杆菌O157:H7的免疫层析试纸条,将制得的试纸条与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。
5.根据权利要求3所述的一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法,其特征在于,大肠杆菌O157:H7单克隆抗体或多克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法,其特征在于,步骤(3)的具体步骤为:首先将100μL含有致病菌的样品溶液与5μL Fe3O4@AuNPs溶液、1μL 1mg/mL的亲和素溶液和5μL制备的脂质体充分混合,室温下反应10分钟,然后缓慢滴加到样品垫上,使其在室温下流动10 min,样品溶液在试纸条上层析结束后,加入30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子,最后,在检测区域加入30μL TMB与H2O2的混合溶液,反应5分钟后,滴加30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子,使用相机拍照,保存图像,采用Image‑Pro Plus 6.0软件中的“split channels”指令将读取的图像分为红、绿、蓝三色灰度图,选择效果最好的灰度图像对样品中的大肠杆菌O157:H7含量进行定量。
7.根据权利要求1‑5之一所述的一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法,其特征在于,步骤(3)的具体步骤为:首先将100μL样品富集预处理的溶液与5μL Fe3O4@AuNPs溶液、1μL
1mg/mL的亲和素溶液和5μL制备的脂质体充分混合,室温下反应10分钟,然后缓慢滴加到样品垫上,使其在室温下流动10 min,样品溶液在试纸条上层析结束后,加入30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子,最后,在检测区域加入30μL TMB与H2O2的混合溶液,反应5分钟后,滴加30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子,使用相机拍照,保存图像,采用Image‑Pro Plus 6.0软件中的“split channels”指令将读取的图像分为红、绿、蓝三色灰度图,选择效果最好的灰度图像对样品中的大肠杆菌O157:H7含量进行定量。
8.根据权利要求1所述的一种定量检测大肠杆菌O157:H7的方法,其特征在于,Fe3O4@AuNPs直径为30‑100nm。