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专利号: 2019107537458
申请人: 齐鲁工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-10-29
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.芽孢表面共展示葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的枯草芽孢杆菌工程菌,利用整合载体pDG1730与芽孢衣壳蛋白cotX和葡萄糖氧化酶基因god‑SpyTag进行融合获得的融合基因片段cotX‑god‑SpyTag连接,然后转化枯草芽孢杆菌WB800n,得到重组枯草芽孢杆菌WB800n‑cotX‑god‑SpyTag,再利用游离质粒pHT01与枯草强启动子P43基因、过氧化氢酶cat基因和SpyCatcher基因进行融合获得的融合基因片段P43‑cat‑SpyCatcher连接,然后电转化重组枯草芽孢杆菌WB800n‑cotX‑god‑SpyTag感受态细胞,即得;

所述融合基因片段cotX‑god‑SpyTag核苷酸序列如SEQ ID No.3所示;

所述融合基因片段P43‑cat‑SpyCatcher核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌在制备葡萄糖酸盐中的应用。

3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,步骤如下:(i)将上述枯草芽孢杆菌工程菌经活化培养、扩大培养后,在35~38℃发酵96h,离心,取芽孢,制得在芽孢表面共展示的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶;

(ii)将步骤(i)制得的芽孢表面共展示的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶加入到葡萄糖溶液中,制得反应溶液;

(iii)将步骤(ii)制得的反应溶液在30~70℃、pH4.0~8.0条件下,搅拌反应12~24h,制得混合溶液;

(iv)将步骤(iii)制得的混合溶液中加入金属碱溶液至pH为10,制得金属碱混合液;

(v)将步骤(iv)制得的金属碱混合液中固定化酶分离,洗涤回收,将反应液旋蒸,结晶,干燥得到葡萄糖酸盐。

4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(i)中,活化培养条件为35~38℃、

180~220rpm培养12~16h,活化培养基为液体LB培养基,组份如下:

10g/L蛋白胨,5g/L酵母浸粉,10g/L NaCl,pH 7.0。

5.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(i)中,扩大培养条件为35~38℃、

180~220rpm培养84~108h,扩大培养培养基为TB培养基,组份如下:丙三醇15mL/L,胰蛋白胨12g/L,酵母浸粉24g/L,MgCl2 2.5g/L,17mM KH2PO4,72mM K2HPO4。

6.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(i)中,离心条件为:4℃、8000rpm的条件下离心10min。

7.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(ii)中,葡萄糖溶液的浓度为20~

200mM。

8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,葡萄糖溶液的浓度为100mM。

9.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(iii)中,反应温度为40~50℃,反应pH为6.0~7.0,搅拌速率为150~400rpm,反应时间为4~8h。

10.如权利要求9所述的应用,其特征在于,所述反应温度为40℃,反应pH为6.0,搅拌速率为200~240rpm,反应时间为6h。

11.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(iv)中,金属碱溶液的浓度为50~

500mM。

12.如权利要求11所述的应用,其特征在于,所述金属碱溶液的浓度为200~400mM。

13.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(v)中,分离采用离心。