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专利号: 2019107165351
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-11-11
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.特异性识别链霉素的短链DNA适配体,其特征在于:具体为选自Ap1‑Ap4所示ssDNA中的一种或多种,Ap1‑Ap4的具体序列如下:SEQ ID No.1:

Ap1:5’‑CGGATCGTGTTCTGCTTTGTTCTGTCGGGTCGTCTGCAGG‑3’;

SEQ ID No.2:

Ap2:5’‑CGTCGACGGATCGTGTTCTGCGCAGGTCGGACG‑3’;

SEQ ID No.3:

Ap3:5’‑CGTCGACGGATCGTGTTCTGCGCAGGTCGACG‑3’;

SEQ ID No.4:

Ap4:5’‑CGTCGACGGATCGTGTTTTTGTTCTGTCGGGTCGTCTGTCGACG‑3’。

2.如权利要求1所述特异性识别链霉素的短链DNA适配体,其特征在于:能够被提高稳定性的基团,提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物,以及用于形成组合物的亲和配基、巯基所修饰。

3.如权利要求1所述特异性识别链霉素的短链DNA适配体的应用,其特征在于:将其用于制备链霉素检测的组合物、试剂盒或芯片中。

4.如权利要求1所述特异性识别链霉素的短链DNA适配体的应用,其特征在于:利用其建立一种基于两轮核酸外切酶III酶切循环放大和DNAzyme催化显色反应的链霉素可视化高灵敏检测的方法。

5.如权利要求4所述的应用,其特征在于链霉素可视化高灵敏检测的方法为:所述适配体先与辅助探针部分配对形成双链,链霉素与适配体特异性结合,将辅助探针释放,释放的辅助探针与Hp1序列部分配对形成双链,利用核酸外切酶Ⅲ识别双链并从3’端水解单链的特性,将Hp1从3’端开始部分酶解,释放出辅助探针以及Hp1的剩余部分序列;

辅助探针循环利用与其它Hp1序列结合;而Hp1的剩余部分是一段能够形成G‑四联体的序列,称为Hp1‑G4,此过程称为第一次信号循环放大CycleⅠ;Hp1‑G4序列能进一步与Hp2序列部分配对形成双链,由核酸外切酶Ⅲ对双链部分进行酶解后释放出能循环利用的Hp1‑G4和剩余的另一段能形成G四联体的单链DNA,称为Hp2‑G4,此过程称为第二次信号循环放大CycleⅡ;在富含钾离子的working buffer中,Hp1‑G4和Hp2‑G4形成G四联体结构,在双氧水

2‑

的存在下催化ABTS 显色,由420nm处的吸光值大小反映靶标链霉素的浓度,检测链霉素。

6.如权利要求5所述的应用,其特征在于链霉素可视化高灵敏检测方法的具体步骤如下:(1)将100μmol/L特异性识别链霉素的短链DNA适配体和辅助探针分别稀释至1μmol/L,各取10μL混合,在95℃下加热5min,随后冰浴10min,再放置至室温;之后加入5μL的不同浓度的的靶标链霉素溶液,在37℃孵育1h,作为待测样品;

(2)将各为100μmol/L的Hp1、Hp2在95℃下加热5min,随后在37℃孵育2h;将孵育后的Hp1、Hp2序列分别稀释至1μmol/L和1.25μmol/L,各取10μL加入到步骤(1)的反应体系中;接着,在冰上向样品中加入2μL的200U ExoⅢ、6μL酶缓冲液以及2μL dd H2O,随后在37℃反应

2h;反应结束后,在70℃下20min灭活ExoⅢ,至此酶辅助两轮信号放大反应完成;

(3)向步骤(2)的溶液中加入10μL 20μmol/L的血红素以及400μL的working buffer,在

37℃下反应1h;随后,加入20μL 50mmol/L的ABTS和10μL 99mmol/L的H2O2,反应10min后,在

420nm处测得样品吸光值;以吸光值对链霉素浓度作图,得到标准曲线;

(4)未知浓度的链霉素样品按步骤(1)~(3)操作,所得吸光值代入标准曲线,计算出样品中链霉素的浓度。

7.如权利要求6所述的应用,其特征在于:步骤(2)所述酶缓冲液具体为10mmol/L Tris‑HCl、10mmol/L MgCl2和1mmol/L DTT,pH 7.0的混合液;

步骤(3)所述working buffer具体为50mmol/L Tris‑HCl,150mmol/L NH4Cl,20mmol/L KCl和体积浓度为0.03%Triton X‑100的混合液。

8.如权利要求6所述的应用,其特征在于:所述辅助探针序列Assisted probre具体如SEQ ID No.5:

5’‑CGTCGACCTGCAGACTTTTTTTTTGAACAAAGCAGGTCGACG‑3’;

HP1序列具体如SEQ ID No.6:

5’‑CTAGACTGGGTAGGGCGGGTTGGGCTACCCAGTCTAGGCTTTGTTCAAAA AAAAAGTCTGCAGGTCGACG‑3’;

HP2序列具体如SEQ ID No.7:

5’‑AGAGGGCATGGGAGTGGGTGCCCTCTCGCCCTACCCAGTC‑3’。