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专利号: 2019105762752
申请人: 北部湾大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-12-30
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种基于海水样本监测中华白海豚种群分布的方法,包括以下步骤:

1)采集监测区域的海水样本;

2)提取海水样本中的总DNA;

3)利用特异性引物对总DNA进行qPCR扩增;

4)根据扩增结果进行监测结果判定。

2.如权利要求1所述的方法,其中,所述特异性引物的序列为:正向引物:5'-CGCTTGGGCAGGAATAGTAGGC-3';

反向引物:5'-GCTGGTCGTCTCCGATAAGTGT-3'。

3.如权利要求1的方法,其中,所述海水样本的采集方法为:用消毒后的采集器收集水样,水样用普通滤网过滤后,再用混合纤维素滤膜过滤,滤膜折叠沉没无水乙醇中冷冻保存。

4.如权利要求3的方法,其中,所述消毒的方法为先用次氯酸消毒,然后用无菌水冲洗,最后用紫外线灭菌。

5.如权利要求1的方法,其中,所述总DNA的提取方法为:将滤膜用无菌剪刀剪碎,通过珠磨式组织研磨器匀浆,8000rpm离心10min,沉淀用DNA提取试剂盒提取DNA;

或者,将滤膜放入无菌水中高速震荡10min,8000rpm离心10min,沉淀用DNA提取试剂盒提取DNA;

或者,将滤膜用无菌剪刀剪碎,CTAB缓冲液浸泡后,8000rpm离心10min,沉淀用DNA提取试剂盒提取DNA。

6.如权利要求1的方法,在qPCR扩增过程中,

反应体系为:TB Green Premix Ex TaqGC 10μL,模板DNA 2μL,正向引物与反响引物各

0.5μL,ddH2O 7.2μL,总体系23.2μL;

反应条件为:95℃预变性5min;95℃变性30s,62℃退火1min,72℃延伸1min,35个循环;

最后72℃延伸5min,4℃保存;

扩增温度以0.2℃的增幅从65℃递增到95℃,通过连续测定扩增对象的荧光强度以获得溶解曲线。

7.如权利要求1所述的方法,其中,所述监测结果判定的方法为:当海水样本的Ct值小于25,溶解曲线的峰值在82℃而且峰型尖锐无锯齿,说明海水样本中含有中华白海豚的eDNA。

8.如权利要求1所述的方法,其中,所述监测结果判定后还进行二次验证,二次验证的过程为:将步骤3)中获得扩增产物纯化,导入载体,再转入感受态细胞克隆,提取质粒,将提取的质粒进行测序,将测序结构与核苷酸序列数据库进行对比。

9.如权利要求8所述的方法,其中,所述克隆的过程为:选用DH5α作为感受态细胞,将导入载体的感受态细胞先接种在SOC培养基上,37℃摇床培养1小时,然后接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上,37℃培养12-16小时,最后挑取白色菌落接种在SOC培养基上,37℃摇床培养24小时。