利索能及
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专利号: 2019103591218
申请人: 湖南师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种基于线性片段同源重组进行须糖多孢菌基因簇阻断的方法,其特征在于:包括以下步骤:(1)在须糖多孢菌基因组中找到ura4作为负筛选标记基因;

(2)在ura4基因的两端设计分别设计一段大小为1 kb的序列用于进行ura4基因替换的同源臂;

(3)采用融合PCR将ura4基因上、下游同源臂与阿泊拉抗性基因进行融合,并与质粒pOJ260进行连接,获得重组质粒pOJ260‑ura4;

(4)将含有重组质粒pOJ260‑ura4的原生质体转入须糖多孢菌中,进行ura4基因的敲除,获得ura4缺失菌株S.pogona‑Δura4,通过线性片段同源重组技术对所述ura4缺失菌株S.pogona‑Δura4进行须糖多孢菌基因簇的阻断;

步骤(4)中通过线性片段同源重组技术对所述ura4缺失菌株S.pogona‑Δura4进行须糖多孢菌14号基因簇的阻断,包括以下步骤:(a)在14号基因簇待阻断区域下游,基因组上位置为2,627,531~2,631,482,设计两对引物Fc14up/Rc14up和Fc14down/Rc14down进行上、下游同源臂扩增,用于将线性片段插入基因组中;

(b)在14号基因簇待敲除区域上游,基因组上位置为2,609,020~2,609,519,设计一对引物Fds/Rds进行direct sequence扩增,用于将引入的外源ura4基因环外敲除;

(c)在须糖多孢菌基因组中设计一对引物Fura4/Rura4进行ura4基因扩增,作为负筛选标记基因进行转化子筛选;

(d)以质粒pOJ260‑cm‑Perm*为模板,设计一对引物Fperm/Rperm用于红霉素强启动子Perm*扩增,用于启动ura4基因表达;

(e)采用融合PCR将步骤(a)到步骤(d)获得的基因片段进行融合,获得可用于14号基因簇阻断的线性重组片段UAc14‑Perm*‑ura4‑DS‑DAc14;

(f)原生质体转化线性重组片段进入S.pogona‑Δura4中进行重组、筛选,获得14号基因簇阻断的工程菌株S. pogona‑Δura4‑Δc14;

重组质粒pOJ260‑ura4表示含有ura4基因上、下游同源臂以及阿拉泊抗性基因的重组质粒,用于须糖多孢菌中ura4基因的敲除;

菌株S.pogona‑Δura4表示敲除ura4基因的须糖多孢菌;

引物Fc14up/Rc14up表示以Fc14up和Rc14up作为一对引物;

Fc14up的序列为GGATATCAACGAATCCAGG;

Rc14up的序列为GCGCGTGCTCGGGTCGGGCTGGTACCGAGCTCAAATTCCATGATGTGTGCAACTG;

引物Fc14down/Rc14down表示以Fc14down和Rc14down作为一对引物;

Fc14down的序列为AGATACAGCCCACGCTTGTC;

Rc14down的序列为GTTCCCAGATCAGCGTCTTG;

引物Fds/Rds表示以Fds和Rds作为一对引物;

Fds的序列为TCCGCGACGAGGTGAGCGACCTCCTCCGAGACTGAAACGTCATGGCTATA CCAAC;

Rds的序列为TTTTACCATTTCAAAGACAAGCGTGGGCTGTATCTCTTCATCCGTTCGTGG TCAC;

引物Fura4/Rura4表示以Fura4和Rura4作为一对引物;

Fura4的序列为ATGACTGATCCGCTGCGGGC;

Rura4的序列为TCAGTCTCGGAGGAGGTCGC;

质粒pOJ260‑cm‑Perm*表示含有红霉素强启动子Perm*的载体;

引物Fperm/Rperm表示以Fperm和Rperm作为一对引物;

Fperm的序列为TTTGAGCTCGGTACCAGCCC;

Rperm的序列为AGCCCGCCCGCAGCGGATCAGTCATCGCTGCTCACCCTACCAACCGGCACGATTG;

线性重组片段UAc14‑Perm*‑ura4‑DS‑DAc14表示用于进行同源重组的片段;

菌株S. pogona‑Δura4‑Δc14表示同时敲除ura4基因和基因簇cluster 14的须糖多孢菌。

2.根据权利要求1所述的基于线性片段同源重组进行须糖多孢菌基因簇阻断的方法,其特征在于:步骤(1)中所述ura4基因序列如序列表SEQ ID №1所示。

3. 根据权利要求1或2所述基于线性片段同源重组进行须糖多孢菌基因簇阻断的方法,其特征在于,步骤(2)中所述用于替换ura4基因的上游同源臂序列如序列表SEQ ID №2所示;所述用于替换ura4基因的下游同源臂序列如序列表SEQ ID №3所示。

4.根据权利要求1或2所述的基于线性片段同源重组进行须糖多孢菌基因簇阻断的方法,其特征在于,步骤(3)中所述利用阿泊拉霉素抗性基因取代ura4基因,使须糖多孢菌具有阿泊拉霉素抗性,在后续对须糖多孢菌进行转化子筛选时,添加阿泊拉霉素。

5.根据权利要求3所述的基于线性片段同源重组进行须糖多孢菌基因簇阻断的方法,其特征在于,步骤(3)中所述利用阿泊拉霉素抗性基因取代ura4基因,使须糖多孢菌具有阿泊拉霉素抗性,在后续对须糖多孢菌进行转化子筛选时,添加阿泊拉霉素。

6. 根据权利要求1或2所述的基于线性片段同源重组进行须糖多孢菌基因簇阻断的方法,其特征在于,步骤(f)所得的须糖多孢菌14号基因簇阻断的工程菌株S. pogona‑Δura4‑Δc14的阻断区域为20 kb序列。

7. 根据权利要求3所述的基于线性片段同源重组进行须糖多孢菌基因簇阻断的方法,其特征在于,步骤(f)所得的须糖多孢菌14号基因簇阻断的工程菌株S. pogona‑Δura4‑Δc14的阻断区域为20 kb序列。

8. 根据权利要求4所述的基于线性片段同源重组进行须糖多孢菌基因簇阻断的方法,其特征在于,步骤(f)所得的须糖多孢菌14号基因簇阻断的工程菌株S. pogona‑Δura4‑Δc14的阻断区域为20 kb序列。