1.一种具有嗜冷特性的碱性果胶酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示。
2.如权利要求1所述的果胶酶所对应的核苷酸序列,所述核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示。
3.如权利要求1所述的果胶酶的制备与纯化方法,其特征是:所述步骤如下:
将大肠杆菌BL21(DE3)/pET-24a(+)-pelV307转接至LB液体培养基中,含50 μg/mL卡纳霉素,在37℃摇床中180 rpm震荡培养至OD600=0 .6,加入终浓度为0 .1 mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),在20℃诱导20 h,发酵停止后,12000 rpm离心10 min,弃菌体,收集上清液,上样于5 mL镍离子亲和层析柱,上样流速为5 ml/min,利用10 mM咪唑洗脱,去除杂蛋白,再利用150 mM的咪唑洗脱,收集洗脱组分,将活性成分透析去除咪唑即可;
所述大肠杆菌BL21(DE3)/pET-24a(+)-pelV307制备方法如下:
将果胶酶PelV307的产酶基因序列,如SEQ ID NO.2所示,以限制性内切酶Nde I和Xho I为酶切位点,设计重组引物如下:正向引物:SEQ ID NO .3:pelV307EF: 5’- CATATGTCTCAAAAATACCTATCTCT-3’ (Nde I),反向引物:SEQ ID NO .4:pelV307ER: 5’- CTCGAGTAGGTATAGTTTACCAGCACC -3’ (Xho I) ,PCR扩增条件为:94℃预变性3分钟;94℃变性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸1分钟,共30个循环;72℃延伸5分钟;4℃稳定15分钟,PCR反应所用DNA聚合酶为Primerstar HS,购自大连宝生物公司, PCR产物用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切,通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物,pET24a (+)质粒DNA,购自美国Invitrogen公司,同样用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切,进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段,酶切所用酶和底物反应体系均参照大连宝生物提供的产品说明操作,双酶切处理的PCR产物和pET-24a(+)质粒载体参照DNA连接酶,购自大连宝生物公司,根据说明书进行连接反应;连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株,购自美国Invitrogen公司,涂布在 Luria-Bertani (LB)培养基固体平板上,含有50 μg/mL卡纳霉素的,37℃温箱中培养12-16小时后,挑取单克隆;将单克隆转接至LB液体培养基中,含有50 μg/mL卡纳霉素,转速为180 rpm的37℃摇床中培养过夜,将单克隆进行序列测定,选择阳性克隆,并将其命名为pET-24a(+)-pelV307,重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),购自大连宝生物公司,将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET-24a(+)-pelV307,保存在-80℃备用;
所述果胶酶PelV307的产酶基因序列pelV307为人工合成序列。
4.如权利要求1所述的果胶酶在裂解大分子果胶中的应用。
5.如权利要求1所述的果胶酶在制备不饱和果胶寡糖中的应用。
6.一种果胶寡糖的制备方法,其特征是,将权利要求1所述的具有嗜冷特性的碱性果胶酶加入900 μl 0.3%果胶底物,20 mM GlyNaOH缓冲液,pH=8.6,在0-60℃下反应10 min。