1.一种构建永生化猪肝星状细胞系的方法,包括以下步骤:(1)将猪肝脏组织破碎后与质量浓度0.05~0.2%的Ⅳ型胶原酶溶液混合,35~38℃加热0.5~2h,得到酶解复合物;
(2)以180~240目筛网过滤所述酶解复合物,取滤液,得到全肝细胞悬液;
(3)将全肝细胞悬液进行第一离心,固液分离,得到第一上清液;所述第一离心的转速为300~600rpm;
(4)将所述第一上清液进行第二离心,固液分离,所得沉淀为猪肝星状细胞;所述第二离心的转速为1200~1800rpm;
(5)将所述猪肝星状细胞接种于容器的孔中,加入星状细胞完全培养基培养至贴壁后换液,依次加入新的星状细胞完全培养基和SV40LT过表达慢病毒进行转染;
所述SV40LT过表达慢病毒具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列;
(6)将转染后的猪肝星状细胞传代3~4次后,筛选阳性克隆,得到永生化猪肝星状细胞系。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述猪肝脏组织与Ⅳ型胶原酶溶液的体积比在1:3以上。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述第一离心和第二离心的离心时间独立的为8~15min。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(4)得到猪肝星状细胞后,还包括扩增步骤:将猪肝星状细胞以星状细胞完全培养基重悬,35~38℃培养50~80min,取培养后未贴壁的细胞转入新的星状细胞完全培养基中培养。
5.根据权利要求1或4所述的方法,其特征在于,步骤(5)中,所述猪肝星状细胞的接种量为0.5×105~2×105个/孔。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤(5)中,所述星状细胞完全培养基的添加量为0.8~2ml/孔。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(5)中,所述SV40LT过表达慢病毒为pHY-SV40LT-Puro慢病毒。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,步骤(6)中,所述筛选阳性克隆时采用2.5~3.5μg/ml嘌呤霉素处理转染后的永生化猪肝星状细胞系,处理3d后存活的即为转染成功的永生化猪肝星状细胞系。
9.权利要求1~8任意一项所述方法构建的永生化猪肝星状细胞系。
10.权利要求9所述永生化猪肝星状细胞系在筛选药物中的应用。