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专利号: 2019100287127
申请人: 齐鲁工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-03-20
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌,其特征在于,所述抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌采用敲除pcf基因获得,所述pcf基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌,其特征在于,所述敲除pcf基因的方法为同源重组单交换方法;所述抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的培养基为添加0.1%葡萄糖、2.5%甘油的LB培养基。

3.根据权利要求1或2所述的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法,其特征在于,包括:步骤1:提取地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)DL-1基因组DNA,以DNA为模板,设计上下游引物pcfF和pcfR,进行PCR扩增,获得pcf基因片段,pcf基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;

步骤2:提取pHT01质粒DNA,以该DNA为模板,设计上下游引物CmrF和CmrR,进行PCR扩增,获得氯霉素抗性Cmr基因片段,Cmr基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;

步骤3:将步骤1制备得到的pcf基因片段与步骤2制备得到的Cmr基因片段,采用重叠延伸PCR进行融合,获得同源重组pcf-Cmr片段;

步骤4:将步骤3获得的同源重组pcf-Cmr片段,酶切,浓缩后,电转化至地衣芽孢杆菌感受态细胞;

步骤5:将步骤4获得的感受态细胞,复苏后,涂布含氯霉素的琼脂固体培养基上,筛选具有氯霉素抗性的阳性重组菌,制得具有抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌。

4.根据权利要求3所述的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法,其特征在于,所述步骤1中,pcfF和pcfR引物序列为:pcfF:CGCGGATCCTGTATAAGCCCTATCAAGATGpcfR:TGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGTTTCACATTGGTTTGAA-CAGPCR扩增体系为:(B.licheniformis)DL-1基因组模板1.5μL,上游引物pcfF 1.5μL,下游引物pcfR1.5μL,2×Phanta Max Master Mix 25μL,ddH2O 20.5μL,总体积50μL;

PCR扩增反应程序为:95℃预变性5min,95℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸20s,30循环,72℃终延伸10min;

所述步骤2中CmrF和CmrR引物序列为:

CmrF:CTACTGTTCAAACCAATGTGAAACTTTTGCTGGCCTTTTGCTC-ACCmrR:CGCGGATCCTAGTGACTGGCGATGCTGTCGGPCR扩增体系为:pHT01质粒模板1.5μL,上游引物CmrF 1.5μL,下游引物CmrR 1.5μL,2×Phanta Max Master Mix 25μL,ddH2O 20.5μL,总体积50μL;

PCR扩增反应程序为:95℃预变性5min,95℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸40s,30循环,72℃终延伸10min。

5.根据权利要求3所述的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法,其特征在于,所述步骤3中,重叠延伸PCR所使用的引物序列为pcfF和CmrR;

重叠延伸PCR扩增分为初次PCR扩增和二次PCR扩增;

所述初次PCR扩增的体系为:pcf基因片段2μL,Cmr基因片段2μL,2×Phanta Max Master Mix 12.5μL,ddH2O 8.5μL,总体积25μL;

初次PCR扩增反应程序为:95℃预变性5min,95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸40s,

5循环,72℃终延伸5min;

所述二次PCR扩增的体系为:在初次PCR扩增体系中补加如下试剂,上游引物pcfF1.5μL,下游引物CmrR1.5μL,2×Phanta Max Master Mix 12.5μL,ddH2O 9.5μL;

所述二次PCR扩增的反应程序为:95℃预变性5min,95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸1min,30循环,72℃终延伸10min。

6.根据权利要求3所述的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法,其特征在于,所述步骤4中,酶切的体系及反应条件如下:pcf-Cmr同源重组片段20μL,BamHⅠ内切酶2μL,10×FastDigest Buffer 4μL,ddH2O 4μL,总体积30μL;37℃,酶切2h,获得酶切后产物;

浓缩的步骤为:向酶切后的产物中,加入1/10体积3mol/L醋酸钠溶液和2.5倍体积的无水乙醇,-20℃放置20min,12000r/min离心5min得DNA沉淀,加入70%乙醇重悬DNA沉淀,

12000r/min离心5min除去乙醇,37℃风干,加入25μL ddH2O重悬,得到pcf-Cmr浓缩重组片段;

电转化的步骤为:将(B.licheniformis)DL-1感受态细胞与pcf-Cmr浓缩重组片段于冰上以10:1比例轻轻混匀,将混合物移入2mm电转杯,2100V、5ms电转,然后立即加入1mL RM培养基,37℃,180r/min复苏4h后涂布于含氯霉素(25μg/mL)的LB固体培养基中培养。

7.根据权利要求3-6任一所述的所述的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法,其特征在于,还包括步骤6:将步骤5制备得到的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌接种到营养条件不同的培养基上,进行营养优化培养。

8.根据权利要求7所述的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法,其特征在于,接种量为单菌落/50ml培养基,培养条件为37℃,200r/min培养24h;所述培养基分别为含质量百分比为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%甘油的LB培养基;

含质量百分比为0.1%、0.3%、0.5%、0.8%、1%葡萄糖的LB培养基;

含质量百分比为0.1%、0.3%、0.5%、0.8%、1%葡萄糖的LBG培养基;

含质量百分比为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%甘油的LBP培养基;

所述LB培养基由以下质量百分比组分组成:蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、氯化钠1%;用

5mol/LNaOH调节培养基pH为7.0;

所述LBG培养基由以下组分组成:蛋白胨1%(质量百分比)、酵母浸粉0.5%(质量百分比)、氯化钠1%(质量百分比)、甘油1%(体积百分比),用5mol/LNaOH调节培养基pH为7.0;

所述LBP培养基由以下质量百分比组分组成:蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、氯化钠1%、葡萄糖0.1%;用5mol/LNaOH调节培养基pH为7.0。

9.根据权利要求8所述的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法,其特征在于,所述培养基为含体积百分比为2.5%甘油的LBP培养基。

10.根据权利要求1或2所述的抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌的应用,其特征在于,应用于淀粉酶及其制剂的生产。