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专利号: 2018114940260
申请人: 浙江海洋大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-29
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.海藻原生质体分离培养和再生植株的方法,其特征在于:利用海藻工具酶分解海藻组织,得到体细胞原生质体,经由培养得再生植株;所述海藻工具酶对海藻组织进行酶解前,先用酒石酸钾钠和聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液浸泡藻体。

2.根据权利要求1所述的海藻原生质体分离培养和再生植株的方法,其特征在于:所述酒石酸钾钠和聚乙烯吡咯烷酮的浓度分别为0.1-0.5M和3-6M,并按体积比1:3-5混合而成。

3.根据权利要求1所述的海藻原生质体分离培养和再生植株的方法,其特征在于:包括以下步骤:

步骤一、选择颜色正常、无腐烂、生长旺盛的藻体,用毛刷清理藻体表面污泥、杂藻和其它附属杂质,用0.005-0.008%的HgCl2溶液消毒5-10s,接着使用消毒海水冲洗干净,切取新鲜藻体顶端幼嫩部分,用滤纸吸干表面水分,将其剪切或研磨成细小的组织块或小的分枝,先在酒石酸钾钠和聚乙烯吡咯烷酮混合溶液中浸泡2-3h后,再利用海藻工具酶溶液进行消化酶解,然后经离心沉淀,获得海藻体细胞原生质;

步骤二、将原生质体培养得到再生细胞壁的细胞,进一步培养即可得到再生植株。

4.根据权利要求2所述的海藻原生质体分离培养和再生植株的方法,其特征在于:所述原生质体分离的操作为:用250-400目筛绢过滤细胞混合液,除去未消化的细胞、细胞团、碎片;取上清液500-850rpm离心8-10min,使原生质体下沉,细胞碎片留在上清液中,弃去上清液,用含有1.0-1.2M葡萄糖的消毒海水进行冲洗和离心2-3次,收集沉淀即得海藻原生质体。

5.根据权利要求2所述的海藻原生质体分离培养和再生植株的方法,其特征在于:所述海藻工具酶为海螺酶或纤维素酶或两者的组合;其中,海螺酶的制备方法为:将海螺洗净暂养于消毒海水中饥饿2-3天,去壳取其消化腺,研磨至匀浆,10000-15000rpm离心5-10min,弃去沉淀,上清液中加入-10~-20℃预冷的丙酮,离心弃去沉淀,再重复加入丙酮离心收集沉淀得原酶液,于-5~-20℃保存备用;原酶液使用时用海水稀释至15-25%;纤维素酶的配制方法为:用40-60mmol/L的柠檬酸或醋酸缓冲液溶解,浓度为10-15%,其中醋酸缓冲液用消毒海水配制。

6.根据权利要求2所述的海藻原生质体分离培养和再生植株的方法,其特征在于:所述海藻工具酶使用时,加入渗透压稳定剂,渗透压稳定剂选自甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、KCl、NaCl中的一种;其中,醇类和糖类的适宜浓度为1.2-2.6M,KCl、NaCl的适宜浓度为0.5-

0.8M。

7.根据权利要求2所述的海藻原生质体分离培养和再生植株的方法,其特征在于:所述酶解条件为:pH为5.5-7.5,15-40℃下酶解2-4.5h。

8.根据权利要求2所述的海藻原生质体分离培养和再生植株的方法,其特征在于:所述原生质体培养方式为:先将海藻酸钠和原生质体等量混合滴于氯化钙溶液中形成固定,再接种到液体培养基中培养;先保持温度22-26℃下暗培养5-7天,然后转为光照培养,光照时间为8-10h/d,光强为2500-3000Lx,每7天更换一半培养基;其中,液体培养基为含萘乙酸和

2,4-氯苯氧乙酸的PES培养基,并以甘露醇和葡萄糖保持培养基渗透压。

9.根据权利要求2所述的海藻原生质体分离培养和再生植株的方法,其特征在于:所述原生质体培养过程,当细胞进行第一次分裂后,在培养基中添加色氨酸和抗坏血酸钠,并调节培养基pH为5.5-5.8,继续培养;色氨酸和抗坏血酸钠的添加量为培养基重量的1-5%和

0.5-2%。