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专利号: 2018111687237
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-06-16
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种无淬灭分子信标荧光探针,其特征在于,所述荧光探针为2-氨基嘌呤荧光探针,该荧光探针的全长序列为:

5'-AAGCTGAGGTCTTGG(2-AP)CACCCTAACCCTAACCCTAATGTCCAAGA-3'。

2.一种基于无淬灭分子信标检测端粒酶活性的检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒包括2-氨基嘌呤荧光探针、端粒酶底物、引物、KF聚合酶、T7外切核酸酶及dNTP,所述2-氨基嘌呤荧光探针的序列为:

5'-AAGCTGAGGTCTTGG(2-AP)CACCCTAACCCTAACCCTAATGTCCAAGA-3';

所述端粒酶底物的序列为:5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3';

所述引物序列为:5'-T*C*T*TGGAC-3',其中*代表硫代修饰;

优选的,该检测试剂盒中还包括缓冲液;进一步优选的,所述缓冲液包括细胞裂解缓冲液、退火缓冲液、NEBuffer 2及Tris-EDTA缓冲液。

3.一种基于无淬灭分子信标检测端粒酶活性的方法,其特征在于,将酶提取物、端粒酶底物混合孵育得到混合物A,向混合物A中加入2-APMB荧光探针、引物、dNTP、KF聚合酶及T7核酸外切酶孵育得到混合物B,并检测混合物的荧光信号强度。

4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述方法步骤如下:

1)端粒酶的提取:一定条件下裂解癌细胞,获取细胞提取物;

2)2-APMB预处理:将单链2-APMB退火形成发夹结构;

3)端粒酶实验反应:将细胞提取物、端粒酶底物及缓冲液混合后孵育,得到端粒酶延伸混合物A;将步骤2)中制备好的2-APMB、引物、dNTP、KF聚合酶及T7核酸外切酶加入混合物A中反应一段时间得到混合物B;

4)荧光检测:以氙灯作为激发光源的荧光分光光度计在室温条件下对混合物B进行检测。

5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤1)中将癌细胞采用磷酸盐缓冲液清洗后,经胰蛋白酶消化后收集,向收集得到的细胞中加入裂解缓冲液孵化制备癌细胞提取物;

优选的,将A549细胞、HeLa细胞、MCF-7细胞在适宜的环境中培养,细胞用磷酸缓冲盐(pH 

7.4)清洗两次后,用胰蛋白酶将细胞从培养皿底部消化下来,并将收集的细胞在2000rpm离心机上4℃离心5-20分钟,1×106个细胞用200μL冷的1×CHAPS裂解缓冲溶液重悬,在冰上孵化20-40分钟,孵育完成后在4℃、12000rpm离心10-30分钟得到细胞提取物;进一步优选的,1×CHAPS裂解缓冲溶液的组成包括:10mM Tris-HCl,pH 7.5,1mM MgCl2,1mM[ethylenebis(oxyethylenenitrilo)]tetraacetic acid,0.1mM苯甲脒,5mMβ-mercaptoethanol,3-0.5%(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio propanesulfonate,

10%甘油,更进一步优选的,其体积比为10000:1000:1000:100:5000:5:100。

6.如权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤2)中2-APMB单链的序列为:5'-AAGCTGAGGTCTTGG(2-AP)CACCCTAACCCTAACCCTAATGTCCAAGA-3'。

7.如权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤2)中单链2-APMB在90-100℃退火5-10分钟;优选的,10μM单链2-AP MB加入1×退火缓冲液;进一步优选的,该退火缓冲液的组成为

10mM Tris-HCl,pH 8.0,50mM NaCl,10mM MgCl2。

8.如权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤3)具体操作如下:将步骤1)得到的细胞提取物、端粒酶底物与10×NEBuffer 2在30-40℃孵育20-40分钟使端粒延伸得到混合物A;

将步骤2)制备好的2-APMB、引物、dNTP、KF聚合酶、T7核酸外切酶加入混合物A中,在30-40℃反应30-90分钟得到混合物B,在70-85℃灭活10-20分钟;优选的,20μL反应体系包含1μL细胞提取物,200nM端粒酶底物和2μL 10×NEBuffer 2,得到混合物A后相应的加入200nM 2-AP MB,200nM引物,500μM dNTP,1U KF聚合酶和10U T7核酸外切酶;进一步优选的,NEBuffer 2的组成为:NaCl 500mM,100mM Tris-HCl,100mM MgCl2,10mM DTT,pH7.9;优选的,端粒酶底物序列为:5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3';引物序列为:5'-T*C*T*TGGAC-3',其中*代表硫代修饰。

9.如权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤4)中荧光分光光度计用340nm的激发波长,在350-550nm的范围内记录荧光光谱,激发和发射狭缝分别设定为5.0和5.0nm;优选的,所述荧光分光光度计为F-7000荧光分光光度计。

10.权利要求1所述荧光探针、权利要求2所述检测试剂盒在检测样品中端粒酶活性方面非诊断治疗目的的应用;优选的,所述样品为癌细胞提取物;优选的,所述检测端粒酶活性方面得诊断治疗目的的应用包括检测端粒酶抑制剂活性方面的应用或筛选端粒酶相关药物靶点方面的应用。