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专利号: 2018109574495
申请人: 陕西师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:无效专利
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种单细胞多巴胺受体亚型mRNA表达的巢式PCR检测方法,其特征在于,针对DAR的5种亚型基因Drd1、Drd2、Drd3、Drd4和Drd5分别设计两轮PCR引物,通过巢式PCR进行两轮扩增,对单个细胞内DAR的5种亚型基因表达进行检测;在巢式PCR扩增的同时,通过对内参基因β‑actin的检测来判断所抽提的核酸质量;

所述的DAR的5种亚型基因Drd1、Drd2、Drd3、Drd4和Drd5分别设计的巢式PCR两轮扩增引物序列分别是:

Drd1第一轮PCR引物_F:TCCGATAGTTGGGCTCATCG;

Drd1第一轮PCR引物_R:CTGTTGCAATACCCCCACCC;

Drd1第二轮PCR引物_F:ATAGTTGGGCTCATCGCTGGDrd1第二轮PCR引物_R:ACCGGGAAGGGGTTCTTCTA;

Drd2第一轮PCR引物_F:AACACACGCTACAGCTCCAA;

Drd2第一轮PCR引物_R:TCATGTCCTCAGGGTGGGTA;

Drd2第二轮PCR引物_F:CCCACTGCTCTTTGGACTCA;

Drd2第二轮PCR引物_R:GCTTGCGGAGAACGATGTAG;

Drd3第一轮PCR引物_F:TGGTTTCAACACAACAGGGGA;

Drd3第一轮PCR引物_R:CCATGGTGGGGCTTAAGGAG;

Drd3第二轮PCR引物_F:CACGGGACAAATGGAGCACA;

Drd3第二轮PCR引物_R:TGGCAGATGCTGTAGTAGCG;

Drd4第一轮PCR引物_F:CTGGGGTCCCACATCAAAGG;

Drd4第一轮PCR引物_R:GCATCCATGGCATCTACCCC;

Drd4第二轮PCR引物_F:CCTGGCCTTTGCTGATTTCC;

Drd4第二轮PCR引物_R:CCACCCAAGAGCAATGGATGA;

Drd5第一轮PCR引物_F:GCATCTACCGCATTGCACAG;

Drd5第一轮PCR引物_R:GACATAGGCAGCAGCGATCT;

Drd5第二轮PCR引物_F:GGCCAACTCCTCTCTCAACC;

Drd5第二轮PCR引物_R:TGTTTACCGTCTGCACGGG;

所述的对单个细胞内DAR的5种亚型基因表达进行检测流程按以下步骤实施:步骤一,单细胞捕获及细胞内容物抽提;

步骤二,使用逆转录酶对抽提得到的细胞内容物直接进行反转录,制备cDNA;

步骤三,将制备的cDNA全部与DAR亚型基因Drd1、Drd2、Drd3、Drd4、Drd5,和内参基因β‑actin第一轮扩增引物的混合物混合,进行多重PCR扩增;

步骤四,以第一轮扩增产物为模板,分别选取DAR亚型基因Drd1、Drd2、Drd3、Drd4、Drd5和内参基因β‑actin的第二轮扩增引物,针对DAR的5种亚型及内参基因进行特异性PCR扩增;

步骤五,琼脂糖凝胶电泳对扩增结果进行检测,判断多巴胺受体基因表达;

所述内参基因β‑actin的扩增引物序列如下:内参基因β‑actin第一轮PCR引物_F:CTGAGCTGCGTTTTACACCC;

内参基因β‑actin第一轮PCR引物_R:ACGCGACCATCCTCCTCTTA;

内参基因β‑actin第二轮PCR引物_F:GACAGCAGTTGGTTGGAGCA;

内参基因β‑actin第二轮PCR引物_R:TTTTGGGAGGGTGAGGGACT。

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述两轮巢式PCR的反应条件为:第一轮扩增:95℃,5min;再进行25个循环:即95℃:30s、55℃:1min、72℃:1min;最后72℃:10min;4℃保存;

第二轮扩增:95℃,5min;再进行30个循环:即95℃:30s、60℃:30s、72℃:30s;最后72℃:10min;12℃保存。