1.芽孢形成相关基因spoⅡE在影响菌株生长及产酶中的应用,其特征在于,所述基因spoⅡE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的芽孢形成相关基因spoⅡE在影响菌株生长及产酶中的应用,其特征在于,所述产酶为产淀粉酶,淀粉酶的酶活是出发菌株的5~6倍。
3.如权利要求1所述的芽孢形成相关基因spoⅡE在影响菌株生长及产酶中的应用,其特征在于,步骤如下:(1)提取克劳氏芽孢杆菌的基因组DNA,以基因组DNA为模板进行PCR扩增,制得克劳氏芽孢杆菌芽孢形成相关基因spoⅡE,基因spoⅡE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
(2)以pHT01质粒为模板进行PCR扩增,扩增获得Cmr片段,Cmr片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
(3)将步骤(1)制得的基因spoⅡE与步骤(2)制得的Cmr片段采用重叠PCR进行融合,获得r融合基因spoⅡE-Cm;
(4)将步骤(3)的融合基因spoⅡE-Cmr经酶切后,浓缩,然后转化克劳氏芽孢杆菌,经筛选得阳性菌株,即可应用于菌体生长与产酶;优选的,所述浓缩后的融合基因spoⅡE-Cmr的浓度为300~500ng/μL。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤(1)中,所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下:spoⅡE-F:CGCGGATCC CCTTAAAAGCGGAGCCAAAAC;
spoⅡE-R:GCCAGCAAAAAGCGTTCCTACAAGTAAGCC;
PCR扩增体系如下,总体积50μL:
2×HiFi-PCR Master 25μL,引物spoⅡE-F 2.5μL,引物spoⅡE-R 2.5μL,克劳氏芽孢杆菌基因组DNA 2.5μL,ddH2O 17.5μL;
PCR扩增程序如下:
95℃预变性5min;95℃变性30s,53℃退火30s,72℃延伸1min45s,共30个循环;72℃继续延伸10min。
5.如权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤(2)中,所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下:Cmr-F:CTTGTAGGAACGCTTTTTGCTGGCCTTTTGCTC;
Cmr-R:CGCGGATCC TAGTGACTGGCGATGCTG;
PCR扩增体系如下,总体积50μL:
2×HiFi-PCR Master 25μL,引物Cmr-F 2.5μL,引物Cmr-R 2.5μL,pHT01质粒2.5μL,ddH2O 17.5μL;
PCR扩增程序如下:
95℃预变性5min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸2min40s,共30个循环;72℃继续延伸10min。
6.如权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤(3)中,所述重叠PCR的扩增引物核苷酸序列如下:spoⅡE-F:CGCGGATCC CCTTAAAAGCGGAGCCAAAAC;
Cmr-R:CGCGGATCC TAGTGACTGGCGATGCTG;
第一轮重叠PCR扩增体系如下,总体积25μL:
2×HiFi-PCR Master 12.5μL,胶回收产物spoⅡE片段2μL,胶回收产物Cmr片段2μL,ddH2O 8.5μL;
第一轮重叠PCR扩增程序如下:
95℃预变性5min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸2min40s,5个循环;72℃继续延伸10min;
第二轮重叠PCR扩增体系为在第一轮PCR体系的基础上补加如下试剂:r
2×HiFi-PCR Master 12.5μL,引物spoⅡE-F 1μL,引物Cm-R 1μL,ddH2O 10.5μL;
第二轮重叠PCR扩增程序如下:
95℃预变性5min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸4min25s,共30个循环;72℃继续延伸10min。
7.如权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤(4)中,所述酶切的反应体系如下,总体积40μL:重叠PCR产物20μL,10×K Buffer 4μL,BamHⅠ内切酶2μL,ddH2O 14μL;
酶切条件为:37℃,1.5h。
8.如权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤(4)中,所述转化克劳氏芽孢杆菌,步骤如下:将浓缩后的酶切产物在1500~1800V的条件下电转化克劳氏芽孢杆菌感受态细胞4~
5ms,然后在37℃条件下于液体复苏培养基中培养3~4h,即得;
其中液体复苏培养基组分如下,均为重量百分比:蛋白胨1%,酵母浸粉0.5%,氯化钠1%,山梨醇9%,甘露醇7%,余量水,pH=7.0~
7.4。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述克劳氏芽孢杆菌感受态细胞的制备步骤如下:挑取新鲜的克劳氏芽孢杆菌单菌落,培养至菌体浓度OD600=0.9~1.0,置于冰上冷却,冷却后离心,然后用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3~5次,电转缓冲液重悬菌体后分装至预冷的无菌EP管,制得克劳氏芽孢杆菌感受态细胞;
其中电转缓冲液组分如下:
质量百分比为9.1%的山梨醇,质量百分比为9.1%的甘露醇,体积百分比为10%的甘油,余量水。
10.如权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤(4)中,所述筛选的步骤如下:将转化后的克劳氏芽孢杆菌涂布含氯霉素的LB平板,37℃培养12~24h,选取阳性菌株,经鉴定,即得;
其中含氯霉素的LB平板为含有氯霉素浓度为25μmol/mL的LB固体培养基。