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专利号: 2018108859280
申请人: 齐鲁工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-10-29
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用,其特征在于,步骤如下:(1)提取克劳氏芽孢杆菌的基因组DNA,以基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得克劳氏芽孢杆菌芽孢形成相关基因sigmaF,所述基因sigmaF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;

(2)以pHT01质粒为模板,经PCR扩增获得Cmr片段,所述Cmr片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;

(3)采用重叠PCR技术将步骤(1)获得的基因sigmaF与步骤(2)获得的Cmr片段进行融合,制得融合基因sigmaF-Cmr,所述融合基因sigmaF-Cmr的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;

r

(4)将步骤(3)制得的融合基因sigmaF-Cm经酶切后,浓缩,转化克劳氏芽孢杆菌感受态细胞,经筛选得阳性重组菌,即可应用于产酶;所述浓缩后的融合基因sigmaF-Cmr的浓度为

300~500ng/μL;

所述产酶为产纤维素酶,纤维素酶的酶活为出发菌株的3~4倍。

2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤(1)中,所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下,下划线为BamH Ⅰ酶切位点:sigmaF-F:CGCGGATCCATGAGTGCAGAGGTGAAAAACAGCGG,sigmaF-R:GTGAGCAAAAGGCCAGCAAAATGAGTGGTCGGCAAT;

PCR扩增体系如下,总体积50μL:

2×HiFi-PCR Master 25μL,上游引物sigmaF-F 2.5μL,下游引物sigmaF-R 2.5μL,克劳氏芽孢杆菌基因组DNA 2.5μL,ddH2O 17.5μL;

PCR扩增程序如下:

95℃预变性5min;95℃变性30s,54℃退火30s,72℃延伸1min15s,共30个循环;72℃继续延伸10min。

3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤(2)中,所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下,下划线为BamHⅠ酶切位点:Cmr-F:CTTGTAGGAACGCTTTTTGCTGGCCTTTTGCTC,Cmr-R:CGCGGATCCTAGTGACTGGCGATGCTGTCGGAATGG;

PCR扩增体系如下,总体积50μL:

2×HiFi-PCR Master 25μL,上游引物Cmr-F 2.5μL,下游引物Cmr-R 2.5μL,pHT01质粒

2.5μL,ddH2O 17.5μL;

PCR扩增程序如下:

95℃预变性5min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸2min45s,共30个循环;72℃继续延伸10min。

4.如权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤(3)中,所述重叠PCR的扩增引物核苷酸序列如下,下划线为BamH Ⅰ酶切位点:sigmaF-F:CGCGGATCCATGAGTGCAGAGGTGAAAAACAGCGG,Cmr-R:CGCGGATCCTAGTGACTGGCGATGCTGTCGGAATGG;

第一轮重叠PCR扩增体系如下,总体积25μL:r

2×HiFi-PCR Master 12.5μL,基因sigmaF 2μL,Cm片段2μL,ddH2O 8.5μL;

第一轮重叠PCR扩增程序如下:

95℃预变性5min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸2min40s,5个循环;72℃继续延伸10min;

第二轮重叠PCR扩增体系为在第一轮PCR扩增体系的基础上补加如下试剂:

2×HiFi-PCR Master 12.5μL,上游引物sigmaF-F 1μL,下游引物Cmr-R 1μL,ddH2O 

10.5μL;

第二轮重叠PCR扩增程序如下:

95℃预变性5min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸4min,共30个循环;72℃继续延伸10min。

5.如权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤(4)中,所述酶切的反应体系如下,总体积40μL:重叠PCR产物20μL,10×K Buffer 4μL,BamH Ⅰ内切酶2μL,ddH2O 14μL;

酶切条件为:37℃,1.5h。

6.如权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤(4)中,所述劳氏芽孢杆菌感受态细胞的制备方法如下:挑取新鲜的克劳氏芽孢杆菌单菌落,37℃,220r/min培养至菌体浓度OD600=0.9~1.0,置于冰上冷却,冷却后离心,然后用预冷的电转缓冲液洗涤菌体3~5次,电转缓冲液重悬菌体后分装至预冷的无菌EP管,制得克劳氏芽孢杆菌感受态细胞;

其中,所述电转缓冲液的组分如下:

质量百分比为9.1%的山梨醇,质量百分比为9.1%的甘露醇,体积百分比为10%的甘油,余量水。

7.如权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤(4)中,所述转化克劳氏芽孢杆菌感受态细胞,步骤如下:将经酶切浓缩后的融合基因sigmaF-Cmr电转化克劳氏芽孢杆菌感受态细胞,电转化的电压为1500~1800V,电击时间为4~5ms,然后在37℃条件下于液体复苏培养基中培养3~

4h,即得;

其中,所述液体复苏培养基组分如下,均为重量百分比:蛋白胨1%,酵母浸粉0.5%,氯化钠1%,山梨醇9%,甘露醇7%,pH=7.0~7.4。

8.如权利要求1所述的应用,其特征在于,步骤(4)中,所述筛选步骤如下:将转化后的克劳氏芽孢杆菌感受态细胞涂布含氯霉素的LB平板,37℃培养12~24h,然后经菌落PCR进行转化子鉴定,筛选获得阳性重组菌;

其中,所述含氯霉素的LB平板为氯霉素浓度为25μmol/mL的LB固体培养基。