1.一种用于检测c-KIT体细胞基因突变引物和探针,其特征在于,包括用于检测所述c-KIT基因11号外显子突变的引物和探针、用于检测所述c-KIT基因9号外显子突变的引物和探针、用于检测所述c-KIT基因13号外显子突变的引物和探针、用于检测所述c-KIT基因17号外显子突变的引物和探针;所述用于检测c-kit Exon11W557G突变的引物对为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5,检测探针为SEQ ID NO:7;所述用于检测c-kit Exon11V559D突变的引物对为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5,检测探针为SEQ ID NO:7;所述用于检测c-kit Exon11V560D突变的引物对为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5,检测探针为SEQ ID NO:7;所述用于检测c-kit Exon11L576P突变的引物对为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6,检测探针为SEQ ID NO:8;所述用于检测c-kit Exon11W557K558del突变的引物对为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:
5,检测探针为SEQ ID NO:7;所述用于检测c-kit Exon9Y503F504insAY突变的引物对为SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10,检测探针为SEQ ID NO:11;所述用于检测c-kit Exon13K642E突变的引物对为SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14,检测探针为SEQ ID NO:15;所述c-kit Exon13V654A突变检测引物对SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,检测探针SEQ ID NO:15;所述用于检测c-kit Exon17D816V突变的引物对为SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19,检测探针为SEQ ID NO:20;所述用于检测c-kit Exon17N822K突变的引物对为SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19,检测探针为SEQ ID NO:20;所述用于检测c-kit Exon17N822K突变的引物对为SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19,检测探针为SEQ ID NO:20。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测c-KIT体细胞基因突变引物和探针,其特征在于,所述探针为经过荧光标记的,其5’端标记有报告基团,3’端标记有荧光淬灭基团。
3.一种c-KIT体细胞突变基因检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括PCR缓冲液、权利要求1所述的用于检测c-KIT体细胞基因突变引物和探针、DNA聚合酶、内参基因和外控基因。
4.根据权利要求3所述的一种c-KIT体细胞突变基因检测试剂盒,其特征在于,所述内参基因包括c-KIT内参特异性引物SEQ ID NO:21-22和c-KIT内参检测探针SEQ ID NO:23。
5.根据权利要求3所述的一种c-KIT体细胞突变基因检测试剂盒,其特征在于,所述外控基因包括c-KIT外控特异性引物SEQ ID NO:24-25和c-KIT外控检测探针SEQ ID NO:26。
6.根据权利要求3所述的一种c-KIT体细胞突变基因检测试剂盒,其特征在于,所述PCR缓冲液由Tris-KCl(pH8.0)、MgCl2(250mM)和dNTP(100mM)组成。
7.一种利用权利要求3-6所述任一项所述试剂盒检测c-KIT体细胞突变基因的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)配制三组PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品,每组PCR反应液包括反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ、反应液Ⅵ;所述反应液Ⅰ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:1-3和SEQ ID NO:5、探针SEQ ID NO:7、内参混合物SEQ ID NO:21-
23;所述反应液Ⅱ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6、探针SEQ ID NO:8、内参混合物SEQ ID NO:21-23;所述反应液Ⅲ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:9-10、探针SEQ ID NO:11、内参混合物SEQ ID NO:21-23;所述反应液Ⅳ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:12-14、探针SEQ ID NO:15、内参混合物SEQ ID NO:21-23;所述反应液Ⅴ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、引物混合物SEQ ID NO:
16-19、探针SEQ ID NO:20、内参混合物SEQ ID NO:21-23;所述反应液Ⅵ包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、外控混合物SEQ ID NO:24-26;所述阳性质控品包含c-KIT基因11号外显子W557G、V559D、V560D、L576P、W557K558del突变质粒,9号外显子Y503F504insAY突变质粒,13号外显子K642E、V654A突变质粒,17号外显子D816V、N822K突变质粒;所述阴性质控品为18兆以上无核酸酶水;
(2)提取纯化待测样本DNA,并对提取的DNA进行浓度及纯度测定;
(3)将步骤(2)中已知浓度的DNA样本用TE稀释成2~20ng/μl;
(4)分别向第一组反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ、反应液Ⅵ中各加入2μl步骤(3)中已稀释备用的样本DNA作为模板;分别向第二组反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ、反应液Ⅵ中各加入2μl阳性质控品作为阳性对照;分别向第三组反应液Ⅰ、反应液Ⅱ、反应液Ⅲ、反应液Ⅳ、反应液Ⅴ、反应液Ⅵ中各加入2μl阴性质控品作为阴性对照;离心后上机扩增;
(5)设置PCR程序,实时荧光PCR检测;
(6)检测结果分析。
8.根据权利要求7所述的一种检测c-KIT体细胞突变基因的方法,其特征在于,所述步骤(1)中PCR反应液中每一种引物的终浓度均为100-400nm,每一种探针的终浓度均为100-
400nm。
9.根据权利要求7所述的一种检测c-KIT体细胞突变基因的方法,其特征在于,所述步骤(5)中PCR扩增反应条件为:52℃30min,(95℃15s,60℃40s)×45cycles,60℃捕捉荧光信号。
10.根据权利要求7所述的一种检测c-KIT体细胞突变基因的方法,其特征在于,所述步骤(5)中荧光检测通道选择FAM、VIC检测通道,其中突变和外控通道选择FAM通道,内参选择VIC通道。