1.一种界面自组装羰基还原酶,其特征在于所述界面自组装羰基还原酶按如下方法制备:将羰基还原酶加入pH6.0~9.0、0.05M的Tirs-HCl缓冲液中,再加入聚苯乙烯的甲苯溶液,在黑暗、40~100r/min、20~40℃条件下,于摇床中震荡反应1~4小时,离心,获得上层为有机相、中间层为界面自组装羰基还原酶、下层为水相的反应体系,取出中间层用甲苯和pH6.0~9.0、0.05M的Tris-HCl缓冲液分别洗涤3~5次,获得界面自组装羰基还原酶。
2.如权利要求1所述界面自组装羰基还原酶,其特征在于所述羰基还原酶加入量以缓冲液体积计为20~200U/ml,所述聚苯乙烯的甲苯溶液浓度为1.0~4.0g/L,所述聚苯乙烯的甲苯溶液与缓冲液体积比为1-3:1。
3.如权利要求1所述界面自组装羰基还原酶,其特征在于所述羰基还原酶来自热带假丝酵母(Candida tropicalis)zjutss412,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心,保藏编号CGMCC No.15016,保藏日期2017年12月4日,保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101。
4.如权利要求3所述界面自组装羰基还原酶,其特征在于所述羰基还原酶按如下方法制备:(1)将热带假丝酵母(Candida tropicalis)CGMCC No.15016经发酵培养获得的湿菌体分散于0.05M、pH 7.9Tris-HCl缓冲溶液中,置于0~4℃冰水浴中,在功率405W条件下进行超声破碎,工作2s,间歇4s,超声破胞20min,破碎后于8000r/min、4℃离心10min,所得上清液,即粗酶液Ⅰ;(2)将酶液Ⅰ置于冰水浴中预冷至0~4℃,边温和地搅拌,边缓慢加入预先研磨成粉的硫酸铵,至硫酸铵饱和度为40%,待其溶解完全,继续冰浴搅拌1h,于10000×g,
4℃,离心10min,得到的沉淀于1~2倍沉淀物体积的0.05M、pH 7.9Tris-HCl缓冲液中复溶,得粗酶液Ⅱ;(3)将粗酶液Ⅱ置于10kD Millipore超滤离心管中,于3500×g,4℃条件下,离心20min,套管中的浓缩液即为羰基还原酶酶液。
5.如权利要求4所述界面自组装羰基还原酶,其特征在于所述湿菌体按如下方法制备:
1)将热带假丝酵母CGMCC No.15016接种到斜面培养基中,于30℃培养3-5天,获得斜面菌体;斜面培养基成分:葡萄糖20g/L,硫酸铵1g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,磷酸氢二钾1.5g/L,氯化钠1g/L,硫酸镁0.1g/L,琼脂20g/L,溶剂为去离子水,pH值自然;2)将斜面上的菌体接种入装液25mL种子培养基的100mL三角瓶中,30℃,120r/min培养24h,获得种子液;种子培养基组成:葡萄糖46g/L,酵母汁25g/L,磷酸二氢钾4g/L,磷酸氢二钾4g/L,氯化钠0.1g/L,溶剂为去离子水,pH值自然;3)将培养24h的种子液,以体积浓度10%的接种量接入装液250mL发酵培养基的1000mL三角瓶中,30℃,120r/min培养24h,将获得的发酵液于8000r/min的离心机中离心20分钟,弃去上清液,获得湿菌体;发酵培养基组成:葡萄糖46g/L,酵母汁25g/L,磷酸二氢钾4g/L,磷酸氢二钾4g/L,氯化钠0.1g/L,溶剂为去离子水,pH值自然。
6.一种权利要求1所述界面自组装羰基还原酶在不对称还原3-羰基-3-苯基丙酸乙酯制备(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯中的应用。
7.如权利要求6所述的应用,其特征在于所述应用的方法为:以界面自组装羰基还原酶为催化剂,以3-羰基-3-苯基丙酸乙酯为底物,以NADH为辅酶,以乙醇为辅助底物,加入乙醇脱氢酶用于辅酶NADH的原位再生,以pH3.0~8.0的Tris-HCl缓冲液与甲苯形成的Tris-HCl/甲苯两相体系为反应介质,在20~40℃、80-120r/min的摇床中反应,反应完全后,将反应液分离纯化,获得所述的(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于所述催化剂用量以缓冲液体积计为5~200U/mL,底物用量以缓冲液体积计为0.010~0.070mol/L,所述乙醇体积用量以缓冲液体积计为
1~12%;所述NADH用量以缓冲液体积计为0.02~0.14mol/L,所述乙醇脱氢酶3000-
120000U/L,所述甲苯与缓冲液体积比为2.5-20:10。
9.如权利要求7所述的应用,其特征在于所述反应结束后,将反应液10000r/min离心
10min,离心,获得含有底物3-羰基-3-苯基丙酸乙酯和(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯的有机相、中间层和水相,水相采用等量乙酸乙酯萃取三次,合并萃取液,旋转蒸发掉大部分乙酸乙酯后与有机相合并,硅胶柱层析,获得(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯;所述中间层回收界面自组装羰基还原酶重复利用。