1.一种用于检测液相蛋白质交互作用的蛋白质芯片,其特征在于:
所述蛋白质芯片是在固相载体的表面点阵固定有探针;所述固相载体为氨基十六烷硫醇和活化槐糖脂化学修饰的金箔芯片;
所述探针包括受体sCD25蛋白、配体IL-2蛋白、sCD25抗体或IL-2抗体。
2.根据权利要求1所述的蛋白质芯片,其特征在于:
槐糖脂酸化后的羧基用EDC和NHS活化后与氨基十六烷硫醇进行连接。
3.一种权利要求1或2所述的用于检测液相蛋白质交互作用的蛋白质芯片的制备方法,其特征在于包括如下步骤:步骤1:固相载体的制备
将1.45mg的氨基十六烷硫醇溶于6ml无水乙醇中获得修饰液1;将NHS和EDC溶于无菌水中作为修饰液2,在所述修饰液2中EDC浓度为150mM,NHS的浓度为50mM;50ug/ml的槐糖脂溶液作为修饰液3;
对金箔芯片进行清洗后,浸入所述修饰液1中,黑暗条件下室温摇荡孵育8-12h,取出后用无水乙醇溶液清洗、氮气吹干;然后将所述修饰液2倒入修饰液3中,室温下反应1小时后点样于所得芯片上并于室温下孵育3小时,取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干,获得固相载体;
步骤2:探针溶液的配制
所述探针溶液包括受体sCD25蛋白溶液、配体IL-2蛋白溶液、sCD25抗体溶液或IL-2抗体溶液,配制过程如下:将受体sCD25蛋白溶于PBST-BSA溶液中,配制浓度≥6.25μg/ml的受体sCD25蛋白溶液;
将配体IL-2蛋白溶于0.1M的乙酸-BSA溶液中,配制浓度≥6.25μg/ml的配体IL-2蛋白溶液;
将sCD25鼠抗人抗体溶于PBST-BSA溶液中,配制浓度≥25μg/ml的sCD25抗体溶液;
将IL-2兔抗人抗体溶于PBST-BSA溶液中,配制浓度≥12.5μg/ml的IL-2抗体溶液;
步骤3:探针的包被
将所述探针溶液点样于步骤1获得的固相载体上,室温下孵育2小时,PBST溶液清洗、氮气吹干,然后将PBST-BSA溶液点样于所得固相载体上,室温下孵育1小时,以封闭剩余的已活化羧基,最后用PBST溶液清洗、氮气吹干,即可获得探针包被的蛋白质芯片。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:
步骤1中,对金箔芯片进行清洗的过程如下:
将金箔芯片浸入丙酮中浸泡1小时,然后置于H2O、氨水及H2O2溶液按体积比5:1:1混合构成的TL1清洗液中,82℃下水浴6分钟,清洗2次,取出后依次用超纯水和无水乙醇清洗,最后用氮气吹干。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:
步骤1中,所述修饰液2和修饰液3的体积比为1:2。
6.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:
所述PBST溶液是由浓度0.01M、pH=7.4的磷酸缓冲液PBS与Tween 20混合配制而成的,在所述PBST溶液中Tween20的体积浓度为0.1%;
所述PBST-BSA溶液是由浓度0.01M、pH=7.4的磷酸缓冲液PBS、Tween20及胎牛血清BSA混合构成,在所述PBST-BSA溶液中Tween20的体积浓度为0.1%,胎牛血清BSA的质量浓度为
0.1%。
7.一种权利要求1或2所述的用于检测液相蛋白质交互作用的蛋白质芯片的应用,其特征在于包括如下步骤:(1)将待检测患者血清稀释4-40倍,然后分别点样于配体IL-2探针包被的蛋白质芯片上,常温条件下孵育1小时,取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干;
(2)将Cy3标记驴抗羊IgG抗体溶于PBST-BSA溶液中,构成浓度2.5μg/ml的IgG荧光二抗溶液;
(3)将浓度不低于25μg/ml的sCD25羊抗人多克隆抗体溶液点样于步骤1获得的孵育过血清的配体IL-2探针包被的蛋白质芯片上,常温下孵育1小时;随后将IgG荧光二抗溶液点样于配体IL-2探针包被的蛋白质芯片上,常温下避光孵育1小时,然后用PBST溶液清洗、氮气吹干;通过芯片扫描仪进行扫描检测,若包被配体IL-2蛋白探针处呈现荧光色,则表明待测患者血清中含有游离受体sCD25蛋白并与包被配体IL-2蛋白探针进行了反应;若包被配体IL-2蛋白探针处无荧光色,则表明待测患者血清中不含有受体sCD25蛋白。
8.一种权利要求1或2所述的用于检测液相蛋白质交互作用的蛋白质芯片的应用,其特征在于包括如下步骤:(1)将待检测患者血清稀释4-40倍,然后分别点样于受体sCD25包被的蛋白质芯片上,常温条件下孵育1小时,取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干;
(2)将浓度不低于12.5μg/ml的Alexa Fluor@647标记IL-2兔抗人单克隆抗体溶液点样于孵育过血清的受体sCD25包被的蛋白质芯片上,常温下避光孵育1小时,然后用PBST溶液清洗、氮气吹干;通过芯片扫描仪进行扫描检测,若包被受体sCD25蛋白探针处呈现荧光色,则表明待测患者血清中游离配体IL-2蛋白并与包被受体sCD25蛋白探针进行了反应,若包被受体sCD25蛋白探针处无荧光色,则表明待测患者血清中不含有配体IL-2蛋白。
9.一种权利要求1或2所述的用于检测液相蛋白质交互作用的蛋白质芯片的应用,其特征在于包括如下步骤:(1)将待检测患者血清稀释4-40倍,然后分别点样于sCD25抗体包被的蛋白质芯片上,常温条件下孵育1小时,取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干;
(2)将浓度不低于12.5μg/ml的Alexa Fluor@647标记IL-2抗体溶液点样于孵育过血清的sCD25抗体包被的蛋白质芯片上,常温下避光孵育1小时,然后用PBST溶液清洗、氮气吹干;通过芯片扫描仪进行扫描检测,若包被sCD25抗体探针处呈现荧光色,则待测患者血清中含有sCD25-IL-2复合体,若包被sCD25抗原探针处无荧光色,则待测患者血清中不含有sCD25-IL-2复合体。
10.一种权利要求1或2所述的用于检测液相蛋白质交互作用的蛋白质芯片的应用,其特征在于包括如下步骤:(1)将待检测患者血清稀释4-40倍,然后分别点样于IL-2抗体包被的蛋白质芯片上,常温条件下孵育1小时,取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干;
(2)将Cy3标记驴抗羊IgG抗体溶于PBST-BSA溶液中,构成浓度2.5μg/ml的IgG荧光二抗溶液;
(3)将浓度不低于25μg/ml的sCD25抗体溶液点样于孵育过血清的IL-2抗体包被的蛋白质芯片上,常温下孵育1小时;随后将步骤2配制的IgG荧光二抗溶液点样于蛋白质芯片上,常温下避光孵育1小时,然后用PBST溶液清洗、氮气吹干;通过芯片扫描仪进行扫描检测,若包被IL-2抗体探针处呈现荧光色,则待测患者血清中含有IL-2-sCD25复合体,若包被IL-2抗体探针处无荧光色,则待测患者血清中不含有IL-2-sCD25复合体。