1.一种用于新发圆环病毒3型(PCV‑3)疫苗免疫评价与野毒感染诊断的试剂盒,该试剂盒包括免疫速测卡、血清稀释液、移液管和干燥剂;所述免疫速测卡包括扇形底板,在扇形底板的相对两边表面上分别沿径向设有检测试纸I和检测试纸II,在扇形底板的圆心处设有金标孔,邻近金标孔设置有加样孔,加样孔分别通过第I样品引流道和第II样品引流道与检测试纸I和检测试纸II连接;
其中,检测试纸I设置有检测线和质控线,分别包被PCV‑3 Cap蛋白和兔免疫球蛋白IgG抗体;检测试纸II设置有检测线和质控线,分别包被PCV‑3 Rep蛋白和兔免疫球蛋白IgG抗体;金标孔中包被有链球菌G蛋白(SPG)胶体金颗粒标记偶联物。
2.一种如权利要求1所述的免疫速测试剂盒的制备方法,包括以下步骤:(1)Cap和Rep蛋白制备
采用基因工程方法合成去除核定位信号区域的Cap蛋白和Rep蛋白基因序列,并进行密码子优化,采用大肠杆菌表达载体pET‑30a进行Cap和Rep蛋白的原核表达,采用柱亲和层析法纯化蛋白,最终获得纯化的表达产物;
(2)免疫速测卡的制备
将Cap蛋白、Rep蛋白、兔免疫球蛋白IgG抗体分别用包被缓冲液稀释后形成喷涂液;用喷膜仪在包被膜上分别喷涂划线相应喷涂液,形成检测线I、检测线II和质控线;
(3)金标孔的制备
取双蒸水置于磁力搅拌器上加热至沸腾,迅速加入浓度为1%的氯金酸溶液至终浓度为0.02%;煮沸5分钟,之后加入浓度为1%的柠檬酸三钠溶液,加样体积为氯金酸溶液的2倍;煮沸20分钟后,形成酒红色澄清溶液,停止加热冷却至室温,再用双蒸水调整浓度为
0.02%,形成胶体金溶液;
用0.1mol/L碳酸钾调节调节胶体金溶液PH至8.0,逐滴加入SPG蛋白,每mL胶体金溶液加入60ug抗体,混匀后静置5分钟;再加入10%牛血清白蛋白溶液,至终浓度1%,混匀后静置5分钟;10000rpm离心20分钟,弃去上清,用洗涤液洗涤1次;沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标蛋白保存液溶解,然后按照20uL/孔的量加入金标孔中;真空干燥3小时,置装有干燥剂的密封袋中保存备用;
(4)免疫速测卡组装
将检测试纸I、II分别固定在扇形底板的相应卡槽内,将金标孔固定于扇形底板的圆心处,形成免疫速测卡;
(5)血清稀释液制备
称取NaCl 8g,KCl 0.2g,Na2HPO4·12H2O 3.63g,KH2PO4 0.24g,溶于900mL双蒸水中,用盐酸调pH值至7.4,加水定容至1L,常温保存备用;
(6)试剂盒制备
用铝箔袋将免疫速测卡和干燥剂封口包装,和移液管、血清稀释液一起组装成试剂盒,用于评价新发PCV‑3疫苗免疫效果和诊断野毒感染。