1.一种检测肉类制品成分的实时定量PCR方法,其特征在于,包括如下步骤:S10、分别提取肉类制品试样的第一基因组DNA、以及与肉类制品试样的物种来源对应的标准样品的第二基因组DNA;
S20、针对所述肉类制品试样中的预设检测成分,设计所述第一基因组DNA和第二基因组DNA中的线粒体NADH氧化还原酶1基因进行PCR扩增所需的特异性引物序列,针对所述第一基因组DNA和第二基因组DNA中的基因18S rRNA,设计所述基因18S rRNA进行PCR扩增所需的18S rRNA引物序列,将所述第一基因组DNA与所述特异性引物、18S rRNA引物配制成第一PCR反应体系,将所述第二基因组DNA与所述特异性引物、18S rRNA引物配制成第二PCR反应体系;
S30、对所述第一PCR反应体系和第二PCR反应体系分别进行实时定量PCR扩增,对应获得第一PCR扩增产物和第二PCR扩增产物,分别读取所述第一PCR扩增产物中的NADH氧化还原酶1的Ct值和18S rRNA的Ct值、以及所述第二PCR扩增产物中的NADH氧化还原酶1的Ct值和18S rRNA的Ct值;
S40、当所述第一PCR扩增产物与所述第二扩增产物的NADH氧化还原酶1的Ct值的差值小于或等于2.0,并且所述第一扩增产物与所述第二扩增产物的18S rRNA的Ct值的差值小于或等于1.0时,判定为对应获得PCR扩增产物所进行的实时定量PCR扩增反应正常;
S50、在判定获得所述第一PCR扩增产物所进行的实时定量PCR扩增反应、以及获得所述第二PCR扩增产物所进行的实时定量PCR扩增反应均正常时,计算所述第一PCR扩增产物与所述第二PCR扩增产物的NADH氧化还原酶1的Ct值的差值ΔCt,当ΔCt大于6.5时,判定呈阴性,即所述肉类制品试样中不含有所述预设检测成分;当ΔCt小于6.5时,判定呈阳性,即所述肉类制品试样中含有所述预设检测成分。
2.如权利要求1所述的检测肉类制品成分的实时定量PCR方法,其特征在于,步骤S10包括:步骤S11、取肉类制品试样、以及与肉类制品试样的物种来源对应的标准样品,对应放入裂解液中并剪碎,再加入蛋白酶K,于55℃反应2~4h后离心,得到第一上清液;
步骤S12、将所述第一上清液用饱和酚抽提后离心,得到第二上清液;
步骤S13、将所述第二上清液用氯仿抽提后离心,得到第三上清液;
步骤S14、向所述第三上清液中加入NaCl溶液或者NaAc溶液进行混合,然后加入无水乙醇或异丙醇进行混合,以沉淀所述肉类制品试样和标准样品中的基因组DNA,离心获得DNA沉淀;
步骤S15、将DNA沉淀用乙醇溶液清洗后吹干,再溶解于无菌水中,对应得到从所述肉类制品试样中提取的第一基因组DNA和从所述标准样品中提取的第二基因组DNA。
3.如权利要求2所述的检测肉类制品成分的实时定量PCR方法,其特征在于,步骤S11中,所述裂解液包括以下组分:摩尔浓度为1M、pH值为7.5的Tris-HCl溶液,摩尔浓度为
0.5M、pH值为8.0的EDTA溶液,摩尔浓度为1M的NaCl溶液,质量浓度为5%的SDS溶液,以及水;其中,所述Tris-HCl溶液、EDTA溶液、NaCl溶液、SDS溶液与水的体积比为1:2:1:4:92。
4.如权利要求2所述的检测肉类制品成分的实时定量PCR方法,其特征在于,在步骤S14之后、步骤S15之前,还包括:向DNA沉淀中加入核糖核酸酶H,于37℃温度下培育30min,获得去除RNA后的DNA沉淀。
5.如权利要求1所述的检测肉类制品成分的实时定量PCR方法,其特征在于,在步骤S20中:所述肉类制品试样中的预设检测成分包括猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉和兔肉中的至少一种;
所述特异性引物序列包括猪、牛、羊、鸡、鸭和兔的线粒体NADH氧化还原酶1基因进行PCR扩增所需的特异性引物序列中的至少一种。
6.如权利要求5所述的检测肉类制品成分的实时定量PCR方法,其特征在于,所述猪、牛、羊、鸡、鸭或兔的线粒体NADH氧化还原酶1基因进行PCR扩增所需的特异性引物序列,以及所述18S rRNA引物序列,对应如下:猪ND1上游引物:5’-CCGGACCTTTCGCCATATTC-3’,猪ND1下游引物:5’-GCTAGTGTTAGGGGCAGGAA-3’,产物大小:246bp;
牛ND1上游引物:5‘-CACTACGACCCGCTACATCT-3‘,牛ND1下游引物:5‘-AGTTGGAAGCTCAGCCTGAT-3’,产物大小:195bp;
羊ND1上游引物:5’-ACGTAGAATATGCTGCCGGA-3’,羊ND1下游引物:5’-GGGTAGGATGCTCGGATTCA-3’,产物大小:199bp;
鸡ND1上游引物:5’-ATGTAGAATATGCCGCCGGA-3’,鸡ND1下游引物:5’-GGATATGAGGCCCGGATTCA-3’,产物大小:199bp;
鸭ND1上游引物:5’-GAAACAAACCGAGCCCCATT-3’,鸭ND1下游引物:5’-TAGGGCGCTTGGGTTTAAGA-3’,产物大小:171bp;
兔ND1上游引物:5’-ACCGGGCTCCATTTGACTTA-3’,兔ND1下游引物:5’-TTCTGGGTTAGTGTGGCTGT-3’,产物大小:179bp;
18S rRNA上游引物:5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’,18S rRNA下游引物:5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’,产物大小:142bp。
7.如权利要求1所述的检测肉类制品成分的实时定量PCR方法,其特征在于,在步骤S20中,所述第一PCR反应体系和第二PCR反应体系均为:2×SYBR Premix ExTaqⅡ10μL,上游引物2μL,下游引物2μL,DNA模板2μL,H2O 4μL,共20μL;其中,所述DNA模板由步骤S10中所提取的所述第一基因组DNA或所述第二基因组DNA稀释至0.5ng/mL获得。
8.如权利要求7所述的检测肉类制品成分的实时定量PCR方法,其特征在于,在步骤S30中,所述实时定量PCR扩增的反应条件为:预变性:95℃,5min;
PCR扩增:95℃,30s;60℃30s;35个循环。
9.如权利要求1所述的检测肉类制品成分的实时定量PCR方法,其特征在于,在步骤S20中,所述第一PCR反应体系和第二PCR反应体系中均包括荧光染料,所述荧光染料为SYBR Green荧光染料、Eva Green荧光染料或LC Green荧光染料。