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专利号: 2018104020750
申请人: 浙江海洋大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-12-30
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.曼氏无针乌贼Spef1,其特征在于:所述曼氏无针乌贼精子鞭毛蛋白Spef1基因的cDNA全长共1135bp,其中5′UTR178bp,3′UTR165bp,开放阅读框区共792bp,编码263个氨基酸;编码蛋白相对分子质量为30.5677kDa,等电点pI为7.03。

2.根据权利要求1所述的曼氏无针乌贼Spef1及其用途,其特征在于:所述曼氏无针乌贼精子鞭毛蛋白Spef1可参与调控曼氏无针乌贼生殖活动的分子生物学分析步骤包括:Spef1基因克隆和表达分析、Spef1基因表达组织特异性分析、Spef1基因的组织表达定位分析。

3.根据权利要求2所述的曼氏无针乌贼Spef1及其用途,其特征在于:所述Spef1基因克隆和表达分析操作为:选取成熟健康的曼氏无针乌贼,用Trizol试剂从脑组织中提取总RNA,将总RNA利用核酸蛋白检测仪测定其在260nm以及280nm处的吸收波长,260/280值在

1.8~2.0之间显示所提取的RNA质量较纯,总RNA有效;测定完成后,取2~3mL上样于1%琼脂糖凝胶电泳,电泳条件设定为135V和150mA,电泳15min,在凝胶成像分析仪中观察RNA电泳条带,提取质量较好的RNA能够观察到明显的28S和18S条带,亮度之比为1.9~2.1:1;使用M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒,以总RNA为模板,合成制备cDNA第一链,以cDNA为模板,以Spef1-1F、Spef1-1R为引物进行Spef1基因核心片段的克隆与扩增,用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,对纯化后的目标片段按照试剂盒操作进行回收;分别以总RNA获得扩增3′RACE、5′RACE所需的模板cDNA,分别经过PCR扩增、检测、回收、连接、测序制得3′端、

5′端序列,利用DNAMAN软件将Spef1基因核心序列以及3′RACE和5′RACE得到的部分片段进行拼接得到曼氏无针乌贼精子鞭毛蛋白Spef1基因全序列。

4.根据权利要求3所述的曼氏无针乌贼Spef1及其用途,其特征在于:所述Spef1基因克隆和表达分析操作过程中用到的引物为:Spef1-1F:AGCCAATGCTACTAAACC

Spef1-1R:TGATTAGGCAATGCTCG

3′-Spef1-inner:CTCAAGTGCAACGTCCAGAC

3′-Spef1-outer:GGTGCTGCAAGTCGTACAAA

3′-adptor:GCGAGCACAGAATTAATATTTTTTTTTTTT

5′-Spef1-inner:GCAAATACTCGCCTGTTA

5′-Spef1-outer:AATTCCTCTTTATGGCTCA

5′-adptor:GGCCAGGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG。

5.根据权利要求2所述的曼氏无针乌贼Spef1及其用途,其特征在于:所述Spef1基因表达组织特异性分析操作为:取健康无损、活力较强的熟雄性曼氏无针乌贼活体解剖,取脑、视叶、胃、鰓、肝、心、精巢、输精管、储精囊、前列腺、精荚、肠、胰的组织样品,选取曼氏无针乌贼β-actin基因作为内参基因,合成的引物经过普通的PCR验证,具有单一目的条带的引物用于Spef1基因组织表达特异性分析;使用相对定量的方法对Spef1基因在曼氏无针乌贼上述13个不同组织中的表达量进行分析,以曼氏无针乌贼β-actin基因作为内参基因,以心脏组织中的表达量作为参照标准,各组织的cDNA在使用前稀释到100ng/μL左右,具体操作-△△Ct方法根据SYBR premix ex taq tm II Kit试剂说明书推荐的方法进行操作,采用2 方法计算相对表达量。

6.根据权利要求5所述的曼氏无针乌贼Spef1及其用途,其特征在于:所述Spef1基因表达组织特异性分析操作中,所用引物包括:Spef1-F:TTATTACTGCTTCAAAGTCGTCT

Spef1-R:CTGATTAGGCAATGCTCGT

Actin-F:TGAGAGGGAGATTGTGCGTG

Actin-R:GAACATAGATTCTGGAGCACGG。

7.根据权利要求2所述的曼氏无针乌贼Spef1及其用途,其特征在于:所述Spef1基因的组织表达定位分析操作为:选取雄性性成熟曼氏无针乌贼个体,活体解剖完整的脑,视叶,以及雄性生殖系统各部分完整组织,置于4%的多聚甲醛溶液中固定过夜,运回实验室之前换75%的乙醇溶液保存,并于4℃冰箱中保存,然后制作组织切片;选取曼氏无针乌贼β-actin基因作为内参基因,合成的引物经过普通的PCR验证,具有单一目的条带的引物用于Spef1基因组织表达特异性分析;利用原位杂交的方法对Spef1基因在曼氏无针乌贼脑、视叶、胃、肠、胰、心脏、肝、鳃、精巢、输精管、前列腺、储精囊、精荚不同组织中的表达量进行分析,以曼氏无针乌贼β-actin基因作为内参基因,以心脏组织中的表达量作为参照标准,各组织的cDNA在使用前稀释到100ng/μL,具体操作方法根据SYBR premix ex taq tm II Kit试剂说明书推荐的方法进行操作,采用2-△△Ct方法计算相对表达量。

8.根据权利要求7所述的曼氏无针乌贼Spef1及其用途,其特征在于:所述Spef1基因的组织表达定位分析步骤中,用于原位杂交探针模板制备的引物为:Probe A-F:CCGGAATTCTTATTACTGCTTCAAAGTCGTCT

Probe A-R:CCCAAGCTTCTGATTAGGCAATGCTCGT。

9.根据权利要求7所述的曼氏无针乌贼Spef1及其用途,其特征在于:所述Spef1基因的组织表达定位分析步骤中,制作组织切片与原位杂交过程中所用的4%多聚甲醛溶液为:将

12g多聚甲醛、1.5mg2’,5’双脱氧腺苷与0.24~0.25mgL-(+)-2,3-二羟基丙酸溶解在300mL 

1×PBS溶液中,55~60℃助溶,溶解后置于4℃避光保存。

10.曼氏无针乌贼Spef1的用途,其特征在于:所述曼氏无针乌贼精子鞭毛蛋白Spef1及其拮抗剂用于在头足类养殖过程中进行生殖调控的用途。