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专利号: 2018102756736
申请人: 辽宁大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-12-30
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.调控基因AurT,其特征在于,所述的新调控基因AurT的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的调控基因AurT在提高金褐霉素产量中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,方法包括如下步骤:

1)利用PCR扩增技术提取金褐链霉菌基因组DNA中的调控基因AurT,将基因AurT克隆到表达质粒载体pSET152中,获得含有调控基因AurT的重组质粒PBJAurT;

2)将含有调控基因AurT 的重组质粒PBJAurT转化进入大肠杆菌 ET12567中,得到转化子;

3)利用大肠杆菌‑链霉菌接合转移的方法,将金褐链霉菌孢子于50℃下热激10min,预萌发后与步骤2)得到的转化子混匀,30ºC 培养 13‑20 小时后,用50ug/ml的安普霉素和

25ug/ml的萘啶酮酸进行覆盖,30℃继续培养24‑48小时后,得到接合转移子;

4)将筛选的接合转移子在发酵培养基中进行发酵培养。

4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤1)具体为:

1)提取野生型金褐链霉菌的总DNA;

2)以T1和T2为引物,以总DNA为模板,进行PCR扩增,得AurT基因;所述的T1和T2的的序列为:T1:5'‑ATGGTGTCCACGGAGAGCAT‑3'T2:5'‑CTAGTCGGCGCGGCCCGTCG‑3'

3)将AurT基因和表达质粒载体pSET152分别通过BamHI和EcoRV限制性内切酶双酶切,经过T4 DNA ligase连接,构建重组质粒PBJAurT。

5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,步骤2)中,PCR扩增体系 (20ul):T1:1ul; T2:1ul; DNA模板:1ul; 10×PCR buffer:2ul; dNTP Mixture:1.6ul; ddH2O:13ul PCR;

PCR扩增反应条件是:94 ℃,5min ; 95℃,30sec , 55 ℃,30sec,72 ℃,1min ;30 个循环;72 ℃,7min;4℃,保温。

6.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤2)具体为:将含有调控基因AurT 的重组质粒PBJAurT转化到大肠杆菌ET12567感受态细胞中,涂布在含有50ug/ml安普霉素的LB培养基上,37℃过夜培养,得到转化子。

7.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤3)中,将金褐链霉菌孢子于50℃下热激10min,预萌发后与步骤2)得到的转化子按重量比1:1混匀。

8.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤4)中,所述的发酵培养基组成为:酵母浸粉0.2%、可溶性淀粉1%、水余量。

9.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤4)中,将接合转移子按10%的接种量接种至发酵培养基中,于29℃,220rpm条件下振荡培养。