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专利号: 2018101479007
申请人: 宁波大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种应用于ALP活性检测及其抑制剂筛选的基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器,其特征在于,所述多功能电化学传感器通过以下方法构建:步骤(1),利用腺嘌呤和HAuCl4水溶液合成腺嘌呤/Au(III)复合物;

步骤(2),预处理金电极,在piranha溶液中加热3~10分钟以去除任何先前的有机层,用氧化铝浆,得到镜面状的样品,用超纯水超声波洗涤,氮气干燥,在0.1M H2SO4水溶液中循环伏安扫描,保持电压为-0.3~+1.5V,时间5~15分钟,最后,将电极用水洗涤并在氮气流下干燥;所述piranha溶液为30%H2O2∶浓H2SO4,体积比3∶7;

步骤(3),通过将预处理的金电极浸入含有0.1~1μM捕获探针的固定缓冲液中6~16小时,然后将含有不同终浓度的ALP、0.1M MgSO4的总体积为2.5~10μL的Tris-HCl缓冲溶液滴至电极表面,37℃孵育20~60分钟,记为电极1;将dTTP,TdT和TdT缓冲液滴加到电极1表面,实现扩增得到富T DNA长链,标记为电极2;将步骤(1)合成的腺嘌呤/Au(III)复合物溶液滴至电极2上,通过氢键作用和碱基互补配对作用与TdT延长的富T DNA长链进行杂交吸附,获得电极3,即为所述多功能电化学传感器;通过改变ALP的浓度,电化学信号响应发生改变,实现ALP活性的定量检测;

其中,步骤(3)中,所述捕获探针是3’-PO3末端的DNA;所述不同终浓度的ALP的浓度范围

0~240U/L;所述Tris-HCl缓冲溶液浓度为10mM,pH 9.0。

2.根据权利要求1所述的多功能电化学传感器,其特征是,利用腺嘌呤/Au(III)复合物的电催化活性以及腺嘌呤/Au(III)复合物与富T DNA长链的特异性杂交吸附作用,采用循环伏安法,设置电位范围为-1.0~0V,检测传感器在含有5mM H2O2的PBS中测量所得溶液的电化学响应,根据电流响应的大小确定与DNA相关酶ALP活性及其抑制剂的关系;其中,PBS溶液浓度为0.1M,pH 7.4。

3.一种基于腺嘌呤/Au(III)复合物的多功能电化学传感器应用于ALP抑制剂评估的方法,其特征是,所述多功能电化学传感器通过以下方法构建:步骤(1),利用腺嘌呤和HAuCl4水溶液合成腺嘌呤/Au(III)复合物;

步骤(2),预处理金电极,在piranha溶液中加热3~10分钟以去除任何先前的有机层,用氧化铝浆,得到镜面状的样品,用超纯水超声波洗涤,氮气干燥,在0.1M H2SO4水溶液中循环伏安扫描,保持电压为-0.3~+1.5V,时间5~15分钟,最后,将电极用水洗涤并在氮气流下干燥;所述piranha溶液为30%H2O2∶浓H2SO4,体积比3∶7;

步骤(3),通过将预处理的金电极浸入含有0.1~1μM捕获探针的固定缓冲液中6~16小时,随后将不同终浓度的Na3VO4水溶液在37℃下加入到ALP反应溶液中,然后将该反应液滴至电极表面孵育20~60分钟,记为电极1’;将dTTP,TdT和TdT缓冲液滴加到修饰电极表面,实现扩增得到富T DNA长链,标记为电极2’;将步骤(1)合成的腺嘌呤/Au(III)复合物溶液滴至电极2’上,通过氢键作用和碱基互补配对作用与TdT延长的富T DNA长链进行杂交吸附,获得电极3’,即为所述多功能电化学传感器;

通过改变Na3VO4水溶液的浓度,电化学信号响应发生改变,实现ALP抑制剂评估;

其中,步骤(3)中,所述捕获探针是3’-PO3末端的DNA;所述不同终浓度的Na3VO4的浓度范围为0~2400μM;所述ALP反应溶液含有10U/L ALP和0.1μM MgSO4。