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专利号: 2018100958004
申请人: 江苏大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2024-10-29
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种pH分辨比色生物传感器构建的方法,其特征在于,步骤如下:

步骤1、制备四氧化三铁纳米颗粒与氧化石墨烯复合物Fe3O4/GO,备用;

步骤2、pH分辨比色生物传感器构建:

步骤2a、移取氧化石墨烯GO水溶液,超声2-4h;加入溶有DNA1的磷酸盐缓冲溶液,振荡

22-24h,离心并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤数次;加入pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液和酚酞PP的乙醇溶液,振荡2~3h;离心并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤三次,得到PP-DNA1-GO,加入和氧化石墨烯水溶液等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液保存于2~4℃下备用;

用孔雀石绿MGCB替代步骤2a的PP,用DNA3替代步骤2a的DNA1,反应条件和步骤2a一致;

得到MGCB-DNA3-GO;

用百里酚酞TP替代步骤2a的PP,用DNA5替代步骤2a的DNA1,反应条件和步骤2a一致;得到TP-DNA5-GO;

用甲基紫MV替代步骤2a的PP,用DNA7替代步骤2a的DNA1,反应条件和步骤2a一致;得到MV-DNA7-GO;

步骤2b、同时移取步骤1制备的Fe3O4/GO溶液,加入溶有DNA2的磷酸盐缓冲溶液,振荡

22-24h,离心并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤数次,得到DNA2-Fe3O4/GO,加入和Fe3O4/GO溶液等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液保存于2~4℃下备用;

用DNA4替代步骤2b的DNA2,条件和步骤2b一致,得到DNA4-Fe3O4/GO;

用DNA6替代步骤2b的DNA2,条件和步骤2b一致,得到DNA6-Fe3O4/GO;

用DNA8替代步骤2b的DNA2,条件和步骤2b一致,得到DNA8-Fe3O4/GO;

所述DNA1序列为5'-GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT TGT CCG ATG CTC CCT TTA-3',DNA2序列为5'-CGC CAC CCA CAC CCG ATC GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT-3',DNA3序列为5'-GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT TGT GGG CCT AGC GAA GGG CAC GAG A-3',DNA4序列为5'-CAC AGA GAG ACA ACA CGT GCC CAA CGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG T-3',DNA5序列为5'-GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT AGA TTG CAC TTA CTA TCT AAT TGA ATA AGC TGG TAT GTG CAG ACG TAA-3',DNA6序列为5'-TTG AAT AAG CTG GTA TAA GGT AAT GCG ATT AAT TGA ATA AGC TGG TAT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT G TG TGT-3',DNA7序列为5'-GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTA ATT GTC ATG GTG GTC CTG TTT GGC GCC-3',DNA8序列为5'-GCG GAG ATG GGG CAT AAT GAG GTG GTA TGG GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TG-3';

步骤2c、按体积比1:1移取PP-DNA1-GO和DNA2-Fe3O4/GO混合得混合液一,接着加入目标物赭曲霉素A适配体OTA aptamer振荡10-12h,磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤数次,得到PP-DNA1-GO-OTA aptamer-DNA2-Fe3O4/GO,加入和混合液一等体积的pH值为

7.4的磷酸盐缓冲溶液保存于2~4℃下备用;

同时按体积比1:1移取MGCB-DNA3-GO和DNA4-Fe3O4/GO混合得混合液二,接着加入目标物黄曲霉毒素B1适配体AFB1 aptamer振荡10-12h,磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤数次,得到MGCB-DNA3-GO-AFB1 aptamer-DNA4-Fe3O4/GO,加入和混合液二等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液保存于2~4℃下备用;

同时按体积比1:1移取TP-DNA5-GO和DNA6-Fe3O4/GO混合得混合液三,接着加入目标物伏马菌素B1适配体FB1 aptamer振荡10-12h,磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤数次,得到TP-DNA5-GO-FB1 aptamer-DNA6-Fe3O4/GO,加入和混合液三等体积的pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液保存于2~4℃下备用;

同时按体积比1:1移取MV-DNA7-GO和DNA8-Fe3O4/GO混合得混合液四,接着加入目标物微囊藻毒素LR适配体MC-LR aptamer振荡10-12h,磁分离并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤数次,得到MV-DNA7-GO-MC-LR aptamer-DNA8-Fe3O4/GO,加入和混合液四等体积的pH值为

7.4的磷酸盐缓冲溶液保存于2~4℃下备用;

步骤2d、分别移取步骤2c中的PP-DNA1-GO-OTA aptamer-DNA2-Fe3O4/GO,MGCB-DNA3-GO-AFB1 aptamer-DNA4-Fe3O4/G,TP-DNA5-GO-FB1 aptamer-DNA6-Fe3O4/GO,MV-DNA7-GO-MC-LR aptamer-DNA8-Fe3O4/GO的溶液混合,磁分离移去上清液;接着分别对应滴加浓度从5ng/mL到500ng/mL的目标物赭曲霉素A OTA,黄曲霉毒素B1 AFB1,伏马菌素B1 FB1和微囊藻毒素LR MC-LR的混合液,磁分离后通过改变上清液和沉淀物的pH值按浓度进行比色分析。

2.如权利要求1所述的一种pH分辨比色生物传感器构建的方法,其特征在于,步骤1、首先50mL氧化石墨烯水溶液超声1h,通氮气30min;之后氮气保护下,逐滴加入

50mL的三氯化铁和硫酸亚铁混合溶液,搅拌12h,剧烈搅拌,将6M氢氧化钠逐滴加入到混合液至pH值达到10.0,90℃下反应1.5h,后冷却至室温,用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤至中性,定容与100mL存于4℃下备用;

所述氧化石墨烯浓度为0.8mg/mL;

所述三氯化铁和硫酸亚铁的质量分别为0.055g,0.048g;

所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.02-0.2M。

3.如权利要求1所述的一种pH分辨比色生物传感器构建的方法,其特征在于,步骤2a中,所述氧化石墨烯GO水溶液浓度为0.4mg/mL;所述pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液的离子强度为0.02M~0.2M;所述酚酞PP,孔雀石绿MGCB,百里酚酞TP,甲基紫MV的浓度分别为2mM,2mM,1.5mM,2mM。

4.如权利要求1所述的一种pH分辨比色生物传感器构建的方法,其特征在于,步骤2a中,氧化石墨烯水溶液、磷酸盐缓冲溶液和酚酞的乙醇溶液体积比为1:0.9:

0.1;

氧化石墨烯水溶液、磷酸盐缓冲溶液和孔雀石绿的乙醇溶液体积比为1:0.9:0.1;

氧化石墨烯水溶液、磷酸盐缓冲溶液和百里酚酞的乙醇溶液体积比为1:0.9:0.1;

氧化石墨烯水溶液、磷酸盐缓冲溶液和甲基紫的乙醇溶液体积比为1:0.9:0.1。

5.如权利要求1所述的一种pH分辨比色生物传感器构建的方法,其特征在于,步骤2a和2b中,所述DNA1,DNA2,DNA3,DNA4,DNA5,DNA6,DNA7,DNA8都是用0.1M pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液配置。

6.如权利要求1所述的一种pH分辨比色生物传感器构建的方法,其特征在于,步骤2c中,所述适配体都是用0.1M pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液配置,所述pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液的离子强度为0.02M~0.2M;

所述赭曲霉素A适配体OTA aptamer序列为5'-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-3',黄曲霉毒素B1适配体AFB1 aptamer序列为5'-GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA-3',伏马菌素B1适配体FB1 aptamer序列为5'-ATA CCA GCT TAT TCA ATT AAT CGC ATT ACC TTA TAC CAG CTT ATT CAA TTA CGT CTG CAC ATA CCA GCT TATT CAA TTA GAT AGT AAG TGC AAT CT-3',微囊藻毒素LR适配体MC-LR aptamer序列为5'-GGC GCC AAA CAG GAC CAC CAT GAC AAT TAC CCA TAC CAC CTC ATT ATG CCC CAT CTC CGC-3'。

7.如权利要求1所述的一种pH分辨比色生物传感器构建的方法,其特征在于,步骤2c中,混合液一和目标物赭曲霉素A适配体的体积比为20:1;

混合液二和目标物黄曲霉毒素B1适配体的体积比为20:1;

混合液三和目标物伏马菌素B1适配体的体积比为20:1;

混合液四和目标物微囊藻毒素LR适配体的体积比为20:1。

8.如权利要求1所述的一种pH分辨比色生物传感器构建的方法,其特征在于,步骤2d中,赭曲霉素A溶液、黄曲霉毒素B1溶液、伏马菌素B1、微囊藻毒素LR均使用纯水配制。