利索能及
我要发布
收藏
专利号: 2017109092445
申请人: 广州润虹医药科技股份有限公司
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-10-10
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的方法,包括以下步骤:

1)从离体皮肤组织中分离表皮干细胞,在表皮干细胞培养基进行传代培养;

所述表皮干细胞培养基为含有氢化可的松、胰岛素、腺嘌呤、青霉素、人表皮生长因子、转铁蛋白、谷氨酸、Y-27632和羧甲基壳聚糖的DMEM培养基;

2)将步骤1)得到的表皮干细胞进行传代培养,待其融合度达到80%时,弃去培养基,用DMEM/F12清洗,加入汗腺细胞诱导培养基进行诱导分化;

所述汗腺细胞诱导培养为含有人表皮生长因子、霍乱毒素、三碘甲状腺原氨酸和氯化乙酰胆碱的DMEM培养基;

3)培养若干天后,待培养基内出现多边形、铺路石样的细胞,即为汗腺细胞,将培养基换成汗腺细胞培养基,培养若干天后,进行传代与增殖;

所述汗腺细胞培养基为含有EGF、牛垂体提取物、青霉素和链霉素的DMEM培养基。

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)中,所述离体皮肤组织为健康幼儿包皮切割术后所弃的包皮。

3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)中,从离体皮肤组织中分离表皮干细胞具体操作为:取3-6岁健康幼儿包皮切割术后所弃的包皮,无菌条件下,氯霉素清洗皮肤组织,加分散酶于4℃作用18-24h,分离表皮组织;无菌PBS清洗表皮组织,0.25%胰酶-EDTA消化4h,加入表皮干细胞培养基终止,以1000r/min速度离心5min,收集表皮细胞,无菌PBS清洗三遍,加入表皮干细胞培养基重悬,至于Matrigel包被的培养板进行培养,得到表皮干细胞。

4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2)中,诱导分化时,每天更换汗腺细胞诱导培养基。

5.如权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于,所述表皮干细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基:0.1-2ng/mL氢化可的松、0.01-1ng/mL胰岛素、1-5×

10-4mol/L腺嘌呤、50-200IU/mL青霉素、5-50ng/mL人表皮生长因子、2-50μg/mL转铁蛋白、1-

10μg/mL谷氨酸、1-20μM Y-27632和0.01-1mg/mL羧甲基壳聚糖。

6.如权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于,所述汗腺细胞诱导培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基:25-100ng/mL人表皮生长因子、0.1-2×10-10mol/L霍乱毒素、0.5-5×10-7mol/L三碘甲状腺原氨酸、2-8×10-5mol/L氯化乙酰胆碱。

7.如权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于,所述汗腺细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基:10-100ng/mL EGF、10-50mg/mL牛垂体提取物、50-200U/mL青霉素和50-200μg/mL链霉素。

8.一种由表皮干细胞诱导分化汗腺细胞的培养基组,包括以下培养基:

表皮干细胞培养基:含有氢化可的松、胰岛素、腺嘌呤、青霉素、人表皮生长因子、转铁蛋白、谷氨酸、Y-27632和羧甲基壳聚糖的DMEM培养基;

汗腺细胞诱导培养:含有人表皮生长因子、霍乱毒素、三碘甲状腺原氨酸和氯化乙酰胆碱的DMEM培养基;

汗腺细胞培养基:含有EGF、牛垂体提取物、青霉素和链霉素的DMEM培养基。

9.如权利要求8所述的培养基组,其特征在于,

所述表皮干细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基:0.1-2ng/mL氢化可的松、0.01-1ng/mL胰岛素、1-5×10-4mol/L腺嘌呤、50-200IU/mL青霉素、5-50ng/mL人表皮生长因子、2-50μg/mL转铁蛋白、1-10μg/mL谷氨酸、1-20μM Y-27632和0.01-1mg/mL羧甲基壳聚糖。

10.如权利要求8所述的培养基组,其特征在于,

所述汗腺细胞诱导培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基:25-100ng/mL人表皮生长因子、0.1-2×10-10mol/L霍乱毒素、0.5-5×10-7mol/L三碘甲状腺原氨酸、2-8×10-5mol/L氯化乙酰胆碱;

所述汗腺细胞培养基为含有以最终浓度计的以下组分的DMEM培养基:10-100ng/mL EGF、10-50mg/mL牛垂体提取物、50-200U/mL青霉素和50-200μg/mL链霉素。