1.一种猪繁殖与呼吸综合症病毒重组ORF5基因,其特征在于,所述重组ORF5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合症病毒重组ORF5基因的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)根据PRRSV标准序列,设计两对特异性引物ORF5和△ORF5,分别扩增PRRSV ORF5基因全长和去除信号肽区域的ORF5基因,扩增ORF5基因的引物序列为:P1:CACTTCATGACACCTGAGAC, P2:AAGGCATATATCATTATTGGCGT;扩增△ORF5的引物序列为:P3:ATAGGATCCGGGAACAGCAGCTC,P4:ATGCTCGAGAGGGGTAGCCGCGG;
2)ORF5引物用于扩增所选取处于不同进化分支上的8株PRRSV ORF5目的基因,8株PRRSV毒株氨基酸序列分别为FJ01 FJ08;
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3)DNA Shuffling
3.1)以选取的各组ORF5基因质粒为模板进行常规PCR扩增,1 %凝胶电泳分析PCR产物,用DNA纯化回收试剂盒回收和纯化目的条带片段的PCR产物;
3.2)将回收纯化后的不同遗传分支的DNA分别用DNaseⅠ酶消化;
3.3)凝胶电泳分析酶切产物,在凝胶成像系统的紫外灯下观察酶切后目的条带,切割目的条带,用DNA纯化回收试剂盒进行回收;
3.4)无引物扩增片段化基因:混合后的段化DNA为模板和引物进行PCR扩增,凝胶电泳分析PCR产物,在凝胶成像系统的紫外灯下切割目的条带,用DNA纯化回收试剂盒进行回收;
3.5)有引物扩增:以无引物扩增片段的回收产物为模板,用特异性引物△ORF5进行PCR扩增,配制1 %的琼脂糖凝胶分析PCR产物,用DNA纯化回收试剂盒进行回收;
4)、重组ORF5基因的筛选
将回收纯化后的PCR产物连接到pMD19-T载体上进行转化,涂布到LB平板上,置于37 ℃恒温箱中培养过夜,在1.5 mL EP管中加入1 ml LB培养基,挑取单菌落于管中37℃过夜培养,对重组菌液进行PCR鉴定,并通过测序筛选出几个重组ORF5基因片段进行原核表达;
5)、重组ORF5基因的连接转化鉴定
将筛选后的重组DNA用T4 DNA连接酶与PET-32a载体连接,全量的连接产物转化至BL21感受态细胞中,后将其涂布到含有氨苄青霉素的LB平板上,置于恒温箱中培养过夜,第二天挑取单菌落,在 EP管中加入含氨苄青霉素的LB培养基,每个EP管中挑取一个单菌落,震荡培养;培养后用质粒小提试剂盒对培养的菌液进行质粒抽提,用BamHⅠ内切酶和Hind Ⅲ内切酶对抽提的质粒双酶切鉴定,重组质粒核苷酸序列SEQ ID NO 1。