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专利号: 201710783693X
申请人: 义乌市凡特塑料制品有限公司
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2024-12-24
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法,其特征在于包括如下步骤:(1)氧化石墨烯的合成

称取12g的K2S2O2和12g的P2O5加入到30mL浓硫酸溶液中,置于加热反应器上进行加热,当温度达到80℃时将5g石墨烯加入到浓硫酸溶液中进行反应,当溶液颜色变成深蓝色时停止加热,并将溶液冷却至室温;随后将溶液进行10倍稀释,并用0.22μm的滤膜进行过滤,除去大块的沉淀物收集滤液,然后置于80℃的条件下过夜干燥;将50mL的浓硫酸置于冰浴条件下冷却,随后加入2g前述处理的石墨烯氧化物,再加入10g的KMnO4,在冰浴中搅拌反应

20min后,加入2g的NaNO3,在室温下搅拌反应2h,再加入500mL超纯水和30%的H2O2终止反应;

得到的反应液用10%的HCl溶液洗涤后再用超纯水洗涤,随后再进行透析,将透析后的溶液进行超声剥离2h,最后将溶液在3000r/min的条件下进行离心除去离心管底部的沉淀,收集的上清液即为石墨烯氧化物;

(2)带有MMP-9切割位点的颈环杂交双链DNA的制备

将含有MMP-9切割位点的二肽DNA1偶联物以1.2:1的摩尔比与DNA2混合进行杂交反应,杂交缓冲液为pH8.0的0.05M Tris-HCl缓冲液,二肽DNA1偶联物的终浓度为12nM,DNA2的终浓度为10nM,在室温下孵育0.5 2h后,得到带有MMP-9切割位点的颈环杂交双链~DNA结构;

二肽DNA1偶联物:5’-ACCGTAGCGT-Gly-Leu-GGTCAACTGC-3’;

DNA2:5’-GCAGTTGACC-GTCTACCGTA-ACGCTACGGT-3’;

(3)荧光信号的测定以及MMP-9的检测

取100μL步骤(1)合成的石墨烯氧化物用0.01M pH7.6的HEPES缓冲液进行10倍稀释,得到浓度为1mg/mL的石墨烯氧化物,然后加入荧光染料标记的DNA3使得DNA3的终浓度为10~

20nM,在室温下孵育20 60min,得到石墨烯氧化物荧光标记DNA3的混合体系;将步骤(2)制~备的双链DNA反应物分装到250μL PCR管中,每管50μL,在每管中分别加入浓度为0nM、

0.1nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM的MMP-9,在室温下振荡反应0.5 2h后,加入50μL前述制备~的石墨烯氧化物荧光标记DNA3的混合反应液组成反应终体系,在室温下孵育反应20~

50min,测定每管的荧光信号强度;

DNA3:5’-TACGGTAGAC-荧光染料-3’。

2.根据权利要求1所述的一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法,其特征在于所述的步骤(2)中二肽DNA1偶联物和DNA2的孵育时间为1h。

3.根据权利要求1所述的一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法,其特征在于所述的步骤(3)中荧光染料为FAM。

4.根据权利要求1所述的一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法,其特征在于所述的步骤(3)中DNA3的终浓度为15nM。

5.根据权利要求1所述的一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法,其特征在于所述的步骤(3)中石墨烯氧化物和DNA3的孵育时间为40min。

6.根据权利要求1所述的一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法,其特征在于所述的步骤(3)中MMP-9和双链DNA反应物的孵育时间为1h。

7.根据权利要求1所述的一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法,其特征在于所述的步骤(3)中反应终体系的孵育反应时间为30min。