1.一种启动子pYLG,核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述启动子pYLG在构建高产长链二元酸的热带假丝酵母中的应用。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,步骤如下:(1)PCR扩增制备核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的启动子pYLG片段;
(2)制备核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的甘油激酶GK片段;
(3)将步骤(1)制得的启动子pYLG片段与步骤(2)制得的甘油激酶GK片段进行PCR重叠连接,制得pYLG-GK片段;
(4)以含有Kanr9k质粒的大肠杆菌为模板,进行PCR扩增,得到抗性基因Kanr片段;所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下:Kanr-up:5’-GACCTTCGTTTGTGCGGATCCTGAGGGAGCCACGGTTGAT-3’,Kanr-down:5’-GAAAAGGGGGACGAGGATCGGTTGAGGCCGTTGAGCAC-3’(5)将步骤(4)得到的抗性基因Kanr片段通过一步法定向克隆无缝克隆连接至pPICzαA载体,制得重组载体pPICzαA-Kanr;
(6)将步骤(3)制得的pYLG-GK片段通过一步法定向克隆无缝克隆连接至步骤(5)制得的的重组载体pPICzαA-Kanr,制得重组载体pPICzαA-Kanr-pYLG-GK;
(7)将步骤(6)制得的重组载体pPICzαA-Kanr-pYLG-GK经电击转化至热带假丝酵母,筛选阳性菌株,制得高产长链二元酸的热带假丝酵母。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(1)中,PCR扩增引物序列如下:pYLG-up:5’-TTAGACCACTCTTTTGAGCTCGGTTGAAATGAATCGGCCG-3’,pYLG-down:5’-ACTACGACGTGGCATTGTTGATGTGTGTTTAATTCAAGAATG-3’,PCR扩增反应体系如下,总体系为50μl:
2×HiFi-PCR Master 25μl,10μmol/L浓度的上游引物(pYLG-up)2μl,10μmol/L浓度的下游引物(pYLG-down)2μl,解脂耶氏酵母基因组DNA 2μl,ddH2O补足50μl;
PCR反应程序如下:
95℃预变性5min;95℃变性30sec,50℃退火30sec,72℃延伸2min,30个循环;72℃延伸
10min;-20℃保存。
5.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(2)中,PCR扩增引物序列如下:GK-up:5’-AATTAAATTTTAACAATGCCACGTCGTAGTAGTAA-3’,GK-down:5’-GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAGCTTTATTTTTTTTTGTTCATTAGTTCTAC-3’;
PCR扩增反应体系如下,总体系为50μl:
2×HiFi-PCR Master 25μl,10μmol/L浓度的上游引物(GK-up)2μl,10μmol/L浓度的下游引物(GK-down)2μl,热带假丝酵母基因组DNA 2μl,ddH2O补足50μl;
PCR反应程序如下:
95℃预变性5min;95℃变性30sec,53℃退火30sec,72℃延伸4min,30个循环;72℃延伸
10min;-20℃保存。
6.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(3)中,所述的重叠PCR的第一步扩增体系如下,总体系为25μl:
2×Taq PCR MasterMix 12.5μl,浓度10μmol/L的pYLG片段2μl,浓度10μmol/L的GK片段回收产物2μl,ddH2O补足25μl;
重叠PCR的第一步扩增程序如下:
95℃预变性5min;95℃变性30sec,52℃退火30sec,72℃延伸30sec,30个循环;72℃延伸10min;-20℃保存;
所述的重叠PCR的第二步扩增体系如下,总体系为25μl:
2×Taq PCR MasterMix 12.5μl,浓度10μmol/L的上游引物(pYLGg-up)2μl,浓度10μmol/L的下游引物(GD-down)2μl,ddH2O补足25μl;
重叠PCR的第二步扩增程序如下:
95℃预变性5min;95℃变性30sec,55℃退火30sec,72℃延伸3min,30个循环;72℃延伸
10min;-20℃保存。
7.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述步骤(4)中,PCR扩增反应体系如下,总体系为50μl:
2×HiFi-PCR Master 25μl,10μmol/L浓度的上游引物(Kanr-up)2μl,10μmol/L浓度的下游引物(Kanr-down)2μl,模板2μl,ddH2O补足50μl;
PCR反应程序如下:
95℃预变性5min;95℃变性30sec,56℃退火30sec,72℃延伸3min,30个循环;72℃延伸
10min;-20℃保存。