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专利号: 2017103845272
申请人: 山东师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-12-30
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种IC50剂量δ-生育酚对RAW264.7或K562细胞亚毒性的分析方法,其特征是,包括以下步骤:(1)确定δ-生育酚对RAW264.7或K562细胞的IC50剂量;

(2)细胞萃取液的制备:

δ-TOH组细胞萃取液的制备:将RAW264.7或K562细胞在相应的δ-生育酚IC50剂量下进行培养,培养后加入冷甲醇使细胞代谢淬灭,然后采用甲醇氯仿水提取法进行超声破碎提取,收集水相;

空白组细胞萃取液的制备:将RAW264.7或K562细胞进行培养,培养后加入冷甲醇使细胞代谢淬灭,然后采用甲醇氯仿水提取法进行超声破碎提取,离心收集水相;

(3)核磁共振预处理:

将δ-TOH组和空白组的水相蒸发后采用含有(3-三甲基硅烷基)-2,2,3,3-四氘代丙酸钠(TSP)的D2O溶解,离心,冻干;将冻干之后的样品用D2O配制的磷酸盐缓冲液溶解,离心,得到上清液;

(4)1H核磁共振检测:将核磁共振预处理后的δ-TOH组和空白组的上清液进行核磁共振检测,获得细胞核磁共振谱图,从而得到RAW264.7或K562细胞样品中代谢物的信号值;

(5)差异性代谢物的筛选:将细胞核磁共振谱图的积分面积进行归一化处理,得到积分面积数据,使用偏最小二乘判别(PLS-DA)和正交-偏最小二乘判别(OPLS-DA)分析数据,并采用排列实验和CV-ANOVA进行验证筛选差异性变量,选取偏最小二乘判别(PLS-DA)中第一主成分的变量权重重要性排序值>0.1的代谢物作为差异性代谢物,并得到差异性代谢物的相对含量值,定量各个差异性代谢物的变化趋势;

(6)代谢通路分析:将确定的差异性代谢物导入京都基因与基因组百科全书数据库中,归属出相关的代谢通路;通过代谢组学数据分析软件MetaboAnalyst对差异性代谢物进行代谢通路富集分析,得到由差异性代谢物归属出的代谢影响分析通路以及代谢序列富集分析通路,代谢影响分析通路的通路影响值>0.1的代谢通路以及代谢序列富集分析通路的通路影响值<0.1的代谢通路均被识别为基于δ-生育酚组受到显著影响的通路;最后从所述受到显著影响的通路中筛选出具有代表性的代谢途径。

2.如权利要求1所述的分析方法,其特征是,步骤(1)中,采用MTT法确定δ-生育酚对RAW264.7或K562细胞的IC50剂量,其中,RAW264.7的IC50为80μM,K562的IC50为110μM。

3.如权利要求1所述的分析方法,其特征是,步骤(2)中,甲醇、氯仿和超纯水的体积比例为4:4:2.8~2.9;优选的,甲醇、氯仿和超纯水的体积比例为4:4:2.85;

优选的,一共超声5次,超声一分钟停一分钟。

4.如权利要求1所述的分析方法,其特征是,步骤(3)中,核磁共振具体的预处理方法是:将δ-TOH组和空白组的水相蒸干后用900μL含有0.1%(w/w)TSP的D2O溶解,离心后取上清液冻干,将冻干的样品用D2O配制的磷酸盐缓冲液溶解至650μL,离心后取上清液至核磁管中,待测。

5.如权利要求1所述的分析方法,其特征是,步骤(4)中,采用配备13C、1H双优化5mm CPTCI三共振反式超低温探头的III 600MHz超导超屏蔽傅立叶变换核磁共振波谱仪检测,其中质子共振频率为600.104MHz,脉冲序列为zg30,谱宽为12019.230Hz,累加次数为256次,空采次数为2次,实验温度为298K,使用Topspin3.2处理谱图。

6.如权利要求1所述的分析方法,其特征是,步骤(5)中,具体的方法是:

核磁共振谱图使用MestReNova 6.11处理,所有谱图添加指数窗函数;手动相位矫正,基线矫正后,用TSP定标,手动切除水峰,选取0.002ppm为间隔标准分段积分;之后对谱图积分面积进行归一化;积分面积数据以Excel文件保存,分组编号;之后,将数据导入SIMCA-P+

12.0软件中;使用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)分析数据;为了确保PLS-DA和OPLS-DA模型建立的可信性,运用排列实验和CV-ANOVA进行验证筛选差异性变量;选取第一主成分在偏最小二乘判别分析(PLS-DA)中VIP值大于1的物质,判定为差异性代谢产物;最后通过人类代谢组数据库(HMDB)以及生物核磁共振数据库(BMRB)进行定性分析,得到差异性代谢产物的种类名称。

7.如权利要求1所述的分析方法,其特征是,步骤(6)中,具体的方法是:将确定的差异性代谢产物导入京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库获得KEGG号,然后MetaboAnalyst(MetPA)中进行通路富集分析,得到由差异性代谢物归属出的代谢通路以及代谢序列富集分析通路,最后通过代谢序列富集的数据得到具有代表性的代谢途径。

8.下述任一应用:

(1)促进甜菜碱代谢试剂在制备治疗由IC50剂量δ-生育酚引起的正常细胞亚毒性的试剂中的应用;

(2)降低无氧呼吸中丙酮酸代谢试剂在制备治疗由IC50剂量δ-生育酚引起的癌细胞亚毒性的试剂中的应用;或者为:乳酸拮抗剂/抑制剂在制备治疗由IC50剂量δ-生育酚引起的癌细胞亚毒性的试剂中的应用;

(3)δ-生育酚拮抗剂/抑制剂在制备促进哺乳动物体内甜菜碱代谢试剂中的应用;

(4)δ-生育酚拮抗剂/抑制剂在制备促进白血病淋巴细胞的呼吸模式向有氧呼吸转化中的应用。

9.一种IC50剂量δ-生育酚对RAW264.7或K562细胞的差异性代谢物的筛选方法,其特征是,其包括以下步骤:(1)确定δ-生育酚对RAW264.7或K562细胞的IC50剂量;

(2)细胞萃取液的制备:

δ-TOH组细胞萃取液的制备:将RAW264.7或K562细胞在相应的δ-生育酚IC50剂量下进行培养,培养后加入冷甲醇使细胞代谢淬灭,然后采用甲醇氯仿水提取法进行超声破碎提取,收集水相;

空白组细胞萃取液的制备:将RAW264.7或K562细胞进行培养,培养后加入冷甲醇使细胞代谢淬灭,然后采用甲醇氯仿水提取法进行超声破碎提取,离心收集水相;

(3)核磁共振预处理:

将δ-TOH组和空白组的水相蒸发后采用含有(3-三甲基硅烷基)-2,2,3,3-四氘代丙酸钠(TSP)的D2O溶解,离心,冻干;将冻干之后的样品用D2O配制的磷酸盐缓冲液溶解,离心,得到上清液;

(4)1H核磁共振检测:将核磁共振预处理后的δ-TOH组和空白组的上清液进行核磁共振检测,获得细胞核磁共振谱图,从而得到RAW264.7或K562细胞样品中代谢物的信号值;

(5)差异性代谢物的筛选:将细胞核磁共振谱图的积分面积进行归一化处理,得到积分面积数据,使用偏最小二乘判别(PLS-DA)和正交-偏最小二乘判别(OPLS-DA)分析数据,并采用排列实验和CV-ANOVA进行验证筛选差异性变量,选取偏最小二乘判别(PLS-DA)中第一主成分的变量权重重要性排序值>0.1的代谢物作为差异性代谢物。

10.根据权利要求9所述的筛选方法得到的IC50剂量δ-生育酚对RAW264.7或K562细胞的差异性代谢物,其特征是:RAW264.7细胞的差异性代谢物为乙酸、赖氨酸、胆碱、精氨酸、丙氨酸、甲醇、半胱胺、甜菜碱和异丁酸;

K562细胞的差异性代谢物为亚牛磺酸、苏氨酸、甲醇、葡萄糖酸内酯、半胱胺、胍乙酸、乳酸、胆碱、甜菜碱、琥珀酸。