1.一种重组质粒，通过从丁酸梭菌中经PCR扩增获得甘油脱水酶基因，然后与从热带假丝酵母中经PCR扩增获得的启动子pGAPg重叠连接，获得pGAPg-GD片段；通过经PCR扩增获得的1,3-丙二醇脱氢酶基因与从热带假丝酵母中经PCR扩增获得的启动子pGAPp重叠连接，获得pGAPp-PDE片段；通过从质粒上PCR扩增获得的终止子基因，经反向连接，获得双向终止子片段；分别向质粒中插入pGAPg-GD片段、pGAPp-PDE片段、双向终止子片段及Kanr基因片段，获得重组质粒；

所述启动子pGAPg核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，启动子pGAPp核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的甘油脱水酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，1,3-丙二醇脱氢酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述终止子基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的Kanr基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.权利要求1所述重组质粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以热带假丝酵母基因组为模板，进行PCR扩增，获得启动子pGAPg片段；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

pGAPg-up:5’-AGATCTAAGAAGAATTTAGTGGTTAGTCG-3’，pGAPg--down:5’-ATCCTTTACTTATCATTGTTAAAATTTAATTTGTAAGTGATTTG-3’；

(2)以热带假丝酵母基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到启动子pGAPp片段；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

pGAPp-up:5’-AGATCTAAGAAGAATTTAGTGGTTAGTCG-3’；

pGAPp-down:5’-TCAAACATACGATAGCTCATTGTTAAAATTTAATTTGTAAGTGATTTG-3’；

(3)以丁酸梭菌的基因组为模板，进行PCR扩增，得到甘油脱水酶GD片段；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

GD-up:5’-CAAATTAAATTTTAACAATGATAAGTAAAGGATTTAGTACCC-3’，GD-down:5’-GGATCCTTACATAACATGTTCAGTTCTTGC-3’；

(4)以克雷伯氏菌的基因组为模板，进行PCR扩增，得到1,3-丙二醇脱氢酶PDE片段；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

PDE-up:5’-TTTAACAATGAGCTATCGTATGTTTGATT-3’，PDE-down:5’-GATTTTCCGCCAGGCATTCTGAGGATCC-3’；

(5)以质粒Kanr9k为模板，进行PCR扩增，得到终止子pTTza片段；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

pTTza-up:5’-AGATCTGTTTGTAGCCTTAGACATGACTG-3’；

pTTza-down:5’-GGATCCGCACAAACGAAGG-3’；

(6)以大肠杆菌的基因组为模板，进行PCR扩增，得到抗性标记Kanr片段；

所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

pKanr9k-up:5’-AGATCTTGAGGGAGCCACGGTTGAT-3’；

pKanr9k-down:5’-GGATCCGGTTGAGGCCGTTGAGCA-3’；

(7)将步骤(1)制得的启动子pGAPg片段与步骤(3)制得的甘油脱水酶片段GD进行PCR重叠连接，制得pGAPg-GD片段；

(8)将步骤(2)制得的启动子pGAPp片段与步骤(4)制得的1,3-丙二醇脱氢酶片段PDE进行PCR重叠连接，制得pGAPp-PDE片段；

(9)将步骤(5)制得的终止子pTTza片段进行终止子间的反向连接；

(10)将步骤(6)中得到的pKanr9k片段，步骤(7)中制得的pGAPg-GD片段，步骤(8)中制得的pGAPg-PDE片段，分别与Ptopo-Blunt-Vector载体连接，制得Ptopo-Blunt-pKanr9k，Ptopo-Blunt-pGAPg-GD，Ptopo-Blunt-pGAPg-PDE质粒；

(11)将步骤(10)制得的Ptopo-Blunt-pGAPg-GD质粒用限制性内切酶BamH I单酶切，然后将单酶切后的质粒去磷酸化；

(12)将步骤(10)制得的Ptopo-Blunt-pGAPp-PDE质粒进行双酶切，所用酶为限制性内切酶Bgl II和BamH I，并回收双酶切产物pGAPp-PDE；

(13)将步骤(9)制得的pTOPO-Blunt-pTTza-pTTza质粒进行双酶切，所用酶为限制性内切酶Bgl II和BamH I，并回收切下的pTTza-pTTz片段；

(14)将步骤(10)制得的Ptopo-Blunt-pKanr9k质粒进行双酶切，所用酶为限制性内切酶Bgl II和BamH I，并回收切下的pKanr9k片段；

(15)将步骤(13)制得的pTTza-pTTza片段连接到步骤(11)制得的磷酸化后的单酶切载体上，制得Ptopo-Blunt-pGAPg-GD-pTTza载体；

(16)将步骤(15)制得的Ptopo-Blunt-pGAPg-GD-pTTza载体进行单酶切，所用酶为限制性内切酶BamH I，将回收的单酶切产物去磷酸化；

(17)将步骤(12)制得的pGAPp-PDE片段连接到步骤(16)制得的磷酸化后的单酶切载体上；

(18)将步骤(17)所得的重组载体单酶切，所用酶为限制性内切酶Bgl II，将回收的单酶切产物去磷酸化；

(19)将步骤(14)所得的Kanr片段连接到步骤(18)中的单酶切载体上获得最终构建的基因重组载体Ptopo-GD-PDE-Kanr。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

2×HiFi-PCR Master 25μl，10μmol/L上游引物2μl，10μmol/L下游引物2μl，模板2.5μl，用ddH2O补足至50μl；

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸

10min，-20℃保存；

优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

2×HiFi-PCR Master 25μl，10μmol/L上游引物2μl，10μmol/L下游引物2μl，模板2.5μl，用ddH2O补足至50μl；

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸

10min，-20℃保存。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

2×Taq PCR MasterMix 25μl，10μmol/L上游引物2μl，10μmol/L下游引物2μl，模板2.5μl，用ddH2O补足至50μl；

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸2.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

优选的，所述步骤(4)中，PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

2×HiFi-PCR Master 25μl，10μmol/L上游引物2μl，10μmol/L下游引物2μl，模板2.5μl，用ddH2O补足至50μl；

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸2.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

2×Taq PCR MasterMi 25μl，10μmol/L上游引物2μl，10μmol/L下游引物2μl，模板2.5μl，用ddH2O补足至50μl；

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

优选的，所述步骤(6)中，PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：

2×HiFi PCR Master 25μl，10μmol/L上游引物2μl，10μmol/L下游引物2μl，模板2.5μl，用ddH2O补足至50μl；

所述的PCR扩增的扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中，重叠PCR第一步扩增体系如下，体系总体积25μl：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，10μmol/L pGAPg片段回收产物2μl，10μmol/L GD片段回收产物2μl，用ddH2O补足至25μl；

所述的重叠PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，所得产物继续进行第二步PCR扩增；

所述第二步PCR扩增体系如下，体系总体积25μl：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，10μmol/L上游引物pGAPg-up 2μl，10μmol/L下游引物GD-down 2μl，用ddH2O补足至25μl；

所述第二步PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸3.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；

优选的，所述步骤(8)中，重叠PCR第一步扩增体系如下，体系总体积25μl：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，10μmol/L pGAPp片段回收产物2μl，10μmol/L PDE片段回收产物2μl，用ddH2O补足至25μl；

所述的重叠PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，所得产物继续进行第二步PCR扩增；

所述第二步PCR扩增体系如下，体系总体积25μl：

2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，10μmol/L上游引物pGAPp-up 2μl，10μmol/L下游引物PDE-down 2μl，用ddH2O补足至25μl；

所述第二步PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存。

7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(9)中，反向连接步骤如下：将步骤(5)制得的pTTza片段连接到载体pTOPO-Blunt上，制得pTOPO-Blunt-pTTza；然后用限制性内切酶Bgl II和BamH I对pTOPO-Blunt-pTTza进行双酶切，将切下的短片段pTTza回收；用限制性内切酶BamH I再对pTOPO-Blunt-pTTza进行单酶切，并回收单酶切产物；将单酶切产物去磷酸化，然后与双酶切得到的pTTza短片段用T4连接酶连接，制得双向终止子结构pTOPO-Blunt-pTTza-pTTza；

进一步优选的，所述的去磷酸化的体系如下，总体系为50ul：待去磷酸化的DNA片段25μl，10×Alkaline Phosphatase Buffer 5μl，CIAP 2μl，用ddH2O补足至50μl；

所述的去磷酸化的条件如下：

37℃或50℃反应30分钟；或者先37℃反应15分钟，然后再50℃反应15分钟；添加5μl，

3mol/L的醋酸钠，并加入125μl的冰乙醇在-20℃下保存30～60min；然后4℃、12000rpm 离心15min回收沉淀，用200μl 70％冰乙醇洗净，4℃、12000rpm离心15min，用20μl以下的H2O溶解沉淀，即得；

进一步优选的，所述连接的反应体系如下，体系总体积20μl：单酶切长片段载体6μl，双酶切短片段2μl，T4 DNA Ligase 1μl，10×T4 DNA Ligase Buffer 2μl，ddH2O补充至20μl；

所述连接的条件为:22℃连接10min；

优选的，所述步骤(10)中，连接体系如下，体系总体积为10μl：待连接片段4μl，Ptopo-Blunt-Vector载体1μl，10×Enhancer 1μl，ddH2O补充至10μl；

所述连接的条件为：20℃-30℃连接5min。

8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(11)、步骤(16)和步骤(18)中，去磷酸化的体系如下，总体系为50ul：待去磷酸化的DNA片段25μl，10×Alkaline Phosphatase Buffer 5μl，CIAP(宝生物碱性磷酸酶)2μl，用ddH2O补足至50μl；

所述的去磷酸化的条件如下：

37℃或50℃反应30分钟；或者先37℃反应15分钟，然后再50℃反应15分钟；添加5μl，

3mol/L的醋酸钠，并加入125μl的冰乙醇在-20℃下保存30～60min；然后4℃、12000rpm离心

15min回收沉淀，用200μl 70％冰乙醇洗净，4℃、12000rpm离心15min，用20μl以下的H2O溶解沉淀，即得；

优选的，所述步骤(15)中，连接的反应体系如下，体系总体积20μl：Ptopo-Blunt-GAPg-GD载体6μl，pTTza-pTTza片段2μl，T4 DNA Ligase 1μl，10×T4DNA Ligase Buffer 2μl，ddH2O补充至20μl；

所述的连接体系的连接条件为:22℃连接10min；

优选的，所述步骤(17)中，连接的反应体系如下，体系总体积20μl：Ptopo-Blunt-pGAPg-GD-pTTza载体6μl，pGAPp-PDE片段2μl，T4 DNA Ligase 1μl，10×T4 DNA Ligase Buffer 2μl，ddH2O补充至20μl；

所述的连接体系的连接条件为:22℃连接10min；

优选的，所述步骤(19)中，所述连接的反应体系如下，体系总体积20μl：Ptopo-Blunt-pGAPg-GD-pTTza-PDE载体6μl，Kanr片段2ul，T4 DNA Ligase 1μl，10×T4 DNA Ligase Buffer:2μl，ddH2O补充至20μl；

所述的连接体系的连接条件为:22℃连接10min。

9.一种转化油脂联产长链二元酸和1,3-丙二醇热带假丝酵母工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(i)制备热带假丝酵母感受态细胞；

(ii)将步骤(i)制得的热带假丝酵母感受态细胞与线性化重组质粒Ptopo-GD-PDE-Kanr混合，冰浴5min后，在1500v电压转化5ms，然后与预冷的1mol/L山梨酸溶液混匀，30℃摇床1h后，筛选，制得转化油脂联产长链二元酸和1,3-丙二醇热带假丝酵母工程菌。

10.权利要求9所述转化油脂联产长链二元酸和1,3-丙二醇热带假丝酵母工程菌在制备长链二元酸和1,3-丙二醇中的应用。