1.内生真菌巴西类壳小圆孢菌株MZ-1,于2016年5月25日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2016279,保藏地址为湖北,武汉,武汉大学。
2.权利要求1所述的内生真菌巴西类壳小圆孢菌株MZ-1,其特征在于,该菌株是从中华剑角蝗的肠道体内获得的。
3.权利要求1或2所述的内生真菌巴西类壳小圆孢菌株MZ-1分离方法,其特征在于,包括如下步骤:
将昆虫中华剑角蝗虫体用蒸馏水冲洗干净,无菌条件下将其置于75%乙醇中消毒1min后用无菌水冲洗4次,再用3%的次氯酸钠消毒1min,无菌水冲洗4次,再用无菌剪刀从腹部剪开虫体取肠剪开用接种环蘸其肠道液划线到PDA培养基平板上,置于28℃恒温培养,定时观察,待长出菌丝后,采用菌丝顶端纯化法,挑取菌丝顶端在新的PDA培养基平板上纯化,当有不同颜色或形态的菌落生长出来以后,继续以菌丝顶端纯化法进行纯化操作直至各个菌落为单一纯培养为止,从中分离得到真菌巴西类壳小圆孢的纯菌株接入PDA斜面,置于28℃培养箱培养48小时,用无菌的液体石蜡封口,4℃冰箱中保藏,即可完成内生真菌巴西类壳小圆孢菌株MZ-1分离。
4.权利要求1-3任一项所述的内生真菌巴西类壳小圆孢菌株MZ-1在制备川芎哚上的应用,其特征在于,具体是从巴西类壳小圆孢菌株MZ-1的代谢产物中制备川芎哚。
5.权利要求4所述的应用,其特征在于,具体制备方法如下:
1)巴西类壳小圆孢菌的培养及发酵
菌株的培养:将保藏菌株接种到PDA培养基平板上,28℃恒温培养箱中培养48小时;
菌株的发酵:将培养好的菌株用接种针挑取一块约1cm×1cm的菌体接种到装有PDA液体培养基的容器中,在温度为28℃,转速为180rpm条件下,用恒温振荡摇床培养5天后,获得种子液,种子液按照5mL接种量接种到装有200mL PDA液体培养基的容器中,在温度为28℃,转速为180rpm条件下,用恒温振荡摇床继续培养20天;
2)次级代谢产物的提取:发酵结束后,分别收集发酵液和菌丝体,发酵液用乙酸乙酯萃取3次,每次发酵液与乙酸乙酯的体积比为1:1,合并所有乙酸乙酯萃取液,经减压浓缩至浸膏状得到发酵液乙酸乙酯萃取物,菌丝体在45℃条件下烘干,然后研磨粉碎,按菌丝体重量:乙酸乙酯体积=1:10加入乙酸乙酯浸泡过夜,超声提取30min,反复提取3次,合并所有乙酸乙酯提取液,经减压浓缩至浸膏状得到菌丝体乙酸乙酯提取物,合并发酵液乙酸乙酯萃取物和菌丝体乙酸乙酯提取物即为次级代谢产物的总提取物;
3)川芎哚的分离纯化:次级代谢产物的总提取物进行正相硅胶柱层析分离,采用氯仿-甲醇=20:1的体积比横梯度洗脱,共得到50个流份,进行TLC检测,展开体系为:氯仿-甲醇=15:1的体积比,在365nm紫外灯下观察荧光,再用碘化必钾喷雾显色,观察有无橙色斑点,若有橙色斑点的流份,合并有橙色斑点的流份后经半制备高效液相精制纯化得到巴西类壳小圆孢菌生产的川芎哚。
6.权利要求4所述的应用,其特征在于,高效液相色谱的洗脱条件:流动相为乙腈与水以40:60的体积比,流速为3.0mL/min,检测波长为237nm,运行时间为30min,川芎哚在HPLC中的保留时间为25min。