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专利号: 2015106822235
申请人: 湖南师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一株球形赖氨酸芽胞杆菌,其特征在于,为球形赖氨酸芽胞杆菌BsX050, Lysinibacillus sphaericus BsX050,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2014160。

2.如权利要求1所述的球形赖氨酸芽胞杆菌的晶体蛋白在制备抗肿瘤药物方面的应用;

所述的球形赖氨酸芽胞杆菌的晶体蛋白的制备方法:挑取单菌落到含20mLLB液体培养基的100mL摇瓶中,30℃,120rpm,培养12h后,按1%的接种量转接到发酵培养基中,30℃,

120rpm,保持20%-40%的相对湿度,振荡培养60h后,8000rpm离心10min,收集菌体;

在离心管中加入0.5mol/L NaCl溶液洗涤菌体,8000rpm离心10min,洗涤3次,0.9%的NaCl溶液重悬菌体,超声破碎;超声功率380W,超声30s,间隔30s,超声10次;并重复超声两次,8000rpm离心10min,收集菌体,并用质量浓度0.9%的NaCl溶液再洗涤菌体2次;后用5%丙酮洗涤菌体3次,8000rpm离心10min,最后用灭菌的双蒸水洗涤3次以上,得到晶体蛋白;

所述“抗肿瘤药物”中的“肿瘤”指乳腺癌细胞系4T1和肝癌细胞系Hep-3B。

3.如权利要求1所述球形赖氨酸芽胞杆菌的活性代谢产物的分离方法,其特征在于,包括以下步骤:方法一:从LB平板上挑取单菌落,转接到含有LB液体培养基的摇瓶中,30℃,120-

160rpm,振荡培养12 h后,按1%的接种量转接于发酵培养基中,于30℃,120-160rpm,20%-

40%的相对湿度,振荡培养48-72 h后,8000-11000rpm离心15min;收集发酵上清液,加入硫酸铵,使发酵液中硫酸铵的质量百分比为30%-80%,于4℃沉淀过夜,8000-11000rpm离心

20min,收集沉淀,用水溶解,过0.22μm滤膜,在蛋白质纯化仪上进行初步分离,收集具有生物活性的组分;

初步分离时,在蛋白质纯化仪上用葡聚糖凝胶柱Superdex 200分离;进一步纯化使用强阴离子交换柱;

或者采用方法二:从LB平板上挑取单菌落,转接到含有LB液体培养基的摇瓶中,30℃,

120-160rpm,振荡培养12 h后,按1%的接种量转接于发酵培养基中,于30℃,120-160rpm,

20%-40%的相对湿度,振荡培养48-72 h后,8000-11000rpm离心15min;收集发酵上清液,加入硫酸铵,使发酵液中硫酸铵的质量百分比为30%-80%,于4℃沉淀过夜,8000-11000rpm离心20min,收集沉淀,用水溶解,加盐酸调pH值至2.0,4℃放置过夜,8000-11000rpm离心

10min收集沉淀,用体积比为2:1的三氯甲烷和甲醇混合液溶解沉淀,8000-11000rpm离心

10min,取上清冷冻干燥,用甲醇溶解,过0.22微米滤膜,利用高效液相色谱仪进一步分离纯化,得到活性代谢产物;

方法二中,分离纯化时,所述高效液相色谱仪中所用色谱柱为C18反相色谱柱。

4.采用如权利要求3所述的分离方法得到的球形赖氨酸芽胞杆菌的活性代谢产物在制备抗肿瘤药物方面的应用;

所述“抗肿瘤药物”中的“肿瘤”指小鼠黑色素瘤细胞B16,人宫颈癌细胞Hela,肝癌细胞Hep-3B,小鼠乳腺癌细胞4T1,人结肠癌细胞HT29,人乳腺癌细胞MCF-7。