1.路氏双髻鲨血管生成抑制因子的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的制备：将破碎匀浆的路氏双髻鲨软骨按固液比1 g：

8～10 mL加入到1.0 mol/L盐酸胍溶液中，4 ℃、振荡抽提32～36 h后，于4 ℃、10 000 r/min离心15～20 min，取上清液装入截留分子量为1 kDa的透析袋中，利用pH 7.6的Tris-HCl缓冲液于4℃以下透析22～24 h，得路氏双髻鲨软骨蛋白粗提液；路氏双髻鲨软骨蛋白粗提液置于4 ℃，缓慢加入4 ℃以下预冷的丙酮至丙酮浓度为30%，静置0.5～1 h后，于4 ℃以下10 000 r/min离心15～25 min，取上清液加入4 ℃以下预冷的丙酮至丙酮浓度达60%，静置0.5～1 h后，4 ℃以下、10 000 r/min离心15～25 min，取沉淀置于截留分子量为1 kDa 的透析袋内用双蒸水于4 ℃以下透析22～24 h，透析液冷冻干燥，得路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分；

2）路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的酶解：将路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分按固液比1 g : 20～25 mL加入浓度0.05 mol/L、pH 9～10的Gly-NaOH缓冲液，得混合液；将混合液温度升至45～55 ℃预热5～10 min，按照路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分质量的1.5～5

2.5%加入酶活力≥2.0×10 U/g的碱性蛋白酶，酶解温度为45～55 ℃，酶解5～6 h后，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15 min后，10 000g离心20～25 min，取上清液，即为软骨活性蛋白组分酶解产物；

3）路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子的制备：将制备的软骨活性蛋白组分酶解产物采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解液，再将酶解液依次经凝胶过滤层析、细胞膜色谱和反相高效液相色谱纯化，得到路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）中的路氏双髻鲨为路氏双髻鲨Sphyrna lewini。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）的凝胶过滤层析、细胞膜色谱和反相高效液相色谱纯化的具体过程为：凝胶过滤层析：将上述超滤酶解液用pH 6.5～7.5磷酸盐缓冲液配成15～25 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-15柱层析分离，用pH 6.5～7.5磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据

215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制作用最强组分为凝胶层析酶解物；

细胞膜色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物用三蒸水配成40～50 μg/mL的溶液，加入到细胞膜色谱柱进行纯化，根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用最强组分为细胞膜色谱纯化酶解物；

RP-HPLC纯化：将上述细胞膜色谱纯化酶解物用三蒸水配成80～100 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制作用得1个高活性多肽Pro-Asp-Tyr-Lys-Phe-Lys，ESI-MS检测分子量为796.90 Da。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述细胞膜色谱条件为：进样量5～

10 μL；细胞膜色谱柱规格为150 mm × 4.6mm，5 μm；柱温为37 ℃；流动相：三蒸水；紫外检测波长215 nm；流速：0.2 mL/min。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述RP-HPLC条件为：进样量15～20 μL；色谱柱是规格为250 mm × 4.6 mm、5 μm的Zorbax C18；流动相为20 %乙腈；紫外检测波长为215 nm。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述细胞膜色谱柱中采用的细胞膜为人脐静脉血管内皮细胞株ECV304的细胞膜。