1.一种家蚕丝素蛋白抗体的制备方法,其特征在于采用如下步骤:
A)提取丝素蛋白:将桑蚕丝以1:100的浴比在质量浓度为0.5%的NaCO3溶液中沸煮30min进行脱胶,脱胶两次后得到丝素;将丝素用去离子水洗净,并于40-60℃的烘箱中放置12h;
将烘干后的丝素在98±2℃的水浴中以1:25的浴比用质量浓度50%的CaCl2溶液溶解1.5h;
将溶解了丝素蛋白的CaCl2溶液自然冷却至室温,然后过滤,用截留分子量为8000-14000的透析袋透析,并每隔4h换一次去离子水,72h后得到纯的丝素蛋白溶液;将丝素蛋白溶液浓缩后冷冻干燥24h;得到粘结成块的丝素蛋白,研磨后得到丝素蛋白粉;
B)用生理盐水将步骤A)得到的丝素蛋白稀释为1-2mg/ml,将稀释后的丝素蛋白与完全弗氏佐剂按体积比1:1混合,然后加入青霉素和链霉素进行乳化处理,得到初次免疫抗原乳化液;使用初次免疫抗原乳化液对兔子进行皮下多点注射,注射量为100μL,进行初次免疫;
C)用生理盐水将步骤A)得到的丝素蛋白稀释为0.5-1.5mg/ml,将稀释后的丝素蛋白与不完全弗氏佐剂按体积比1:1混合,然后加入青霉素和链霉素乳化处理,得到强免疫抗原乳化液;在完成步骤B)初次免疫后的第3周和第5周时,分别使用强免疫抗原乳化液对兔子进行皮下多点注射,注射量为100μL,进行加强免疫;
D)重复步骤C)所述的加强免疫,当兔子血样中的抗体效价达到1/20000时,杀死兔子并收集血液,分离得到抗血清;
E)将收集到的血液置于室温下凝固,然后将凝固血液置于37℃温箱内放置30min,再置于4℃冰箱中12h,使血块充分收缩并得到完全析出的抗血清;收集抗血清,在温度为4℃于
3000g条件下离心15min,分装上清液,放置于-80℃储存备用;
F)准备1.5g的蛋白A填料,用6-7ml pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液混合,搅拌后抽真空
15min,得到无气泡的蛋白A填料;然后将蛋白A填料在保证无气泡的条件下加入到玻璃柱中,得到蛋白柱;用20ml、0.05mol/l、pH7.4的磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱进行清洗,清洗流速为60ml/h;用0.05mol/l,pH7.4的磷酸盐缓冲溶液,将15ml的抗血清稀释至20ml,稀释后加入到蛋白柱中进行上样,重复上样一次;
用30ml、0.05mol/l、pH7.4的磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱进行清洗,清洗流速为60ml/h;
用pH 3.0、0.2mol/l的甘氨酸溶液对抗体进行洗脱;洗脱完成后用pH7.4、0.05mol/l的磷酸盐缓冲溶液洗涤蛋白柱,将得到纯化后的抗体装于离心管中并于4℃保存待用;
G)特异性检测:取步骤A)制得的丝素蛋白用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液配制成
1μg/ml的浓度包被在酶标板中12h,用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤三次;每孔加入200μL,质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液在37℃下封闭2h;用PH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次,然后将丝素蛋白抗体分别用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液稀释1:240000,1:60000,1:
20000,1:10000,1:5000,1:1000,1:200倍,每孔加入100μL丝素蛋白抗体,37℃下孵育1h,用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤5次;每孔加入100μL的辣根过氧化酶标二抗,37℃下孵育1h,所述二抗采用质量浓度为1%的牛血清白蛋白稀释5000倍;最后每孔加入100μL的质量浓度为1%的四甲基联苯胺溶液于黑暗处显色,10min后,加入100μL 2mol/L的 H2SO4终止反应;用酶标仪测定OD450nm,根据OD450nm值,对抗原抗体的结合性情况进行判断;当OD值达到阳性标准时就确定样品中含有丝素;若样品中不含有丝素,则OD就会低于阳性标准,根据此标准,判断丝素蛋白的存在。