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专利号: 2014107235794
申请人: 淮安皓运生物科技有限公司
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2024-12-10
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法,其特征在于:利用高分子材料和人新生皮肤成纤维细胞柱交替打印出血管形状,经过融合后,去除上述高分子材料,构造出组织工程血管;向血管中灌注晚期内皮祖细胞,在生物反应器内经过7天的体外动态培养,获得分化的组织工程血管,所述高分子材料为普朗尼克F127、聚N-异丙基丙烯酰胺、甲基纤维素或阮藻酸钠的一种;

具体步骤如下:

步骤a、细胞处理:

(a1)从培养箱中取出装有人新生皮肤成纤维细胞的培养皿,用磷酸盐缓冲液清洗后,用胰蛋白酶消化细胞;

(a2)处理后的细胞重悬于细胞培养液,置于组织培养瓶中;

(a3)培养瓶在旋转振动器上培养,使受损细胞恢复附着能力,离心把细胞分离出来;

(a4)利用3D打印机将细胞柱挤出在特制的、无粘着力的聚四氟乙烯或琼脂糖基上,过夜培养,使细胞柱成熟;

步骤b、高分子材料处理:

选择液态的上述高分子材料,当高分子材料吸入打印头上的微量吸液管时,浸入磷酸盐缓冲液中,使得材料固化,可获得连续挤出的条状高分子材料;

步骤c、3D血管打印:

3D打印机含有两个打印头,一个挤出条状高分子材料,另一个挤出人新生皮肤成纤维细胞柱,打印前编写打印程序,输入电脑;

(c1)装载:将附有微量吸液管的打印头A伸入装有液体高分子材料的小瓶中,将高分子材料吸入吸液管中;

(c2)挤出:将交联后的高分子材料挤出在一个培养皿中;

(c3)当需要细胞打印时,将成熟的细胞柱吸入微量吸液管,装在打印头B上,打印方法同高分子材料;

(c4)打印完成后,经过2-4天的融合过程,去除高分子材料,获得血管结构;步骤d、内皮细胞灌注:(d1)借助流式细胞仪,从外周血中提取分离晚期内皮祖细胞;

(d2)将分离出的晚期内皮祖细胞注入之前获得的血管内腔,旋转;

(d3)对步骤(d2)得到的血管在生物反应器进行为期7天的体外培养。

2.如权利要求1所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法,其特征在于:步骤(a3)中,培养瓶在旋转振动器上在体积浓度为5%的CO2环境、37℃下培养1h,转速

3500rpm下离心分离。

3.如权利要求1所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法,其特征在于:所述高分子材料为普朗尼克F127、聚N-异丙基丙烯酰胺或甲基纤维素时,在步骤(c1)装载的步骤后还有交联的步骤:将装载有液体高分子材料的吸液管浸入装有磷酸盐缓冲液的小瓶中,使高分子材料快速交联。

4.如权利要求1所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法,其特征在于:步骤(c4)中,采用改变温度的方式去除普朗尼克F127、聚N-异丙基丙烯酰胺或甲基纤维素。

5.如权利要求1所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法,其特征在于:步骤(c4)中,采用螯合的方式去除阮藻酸钠。

6.如权利要求5所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法,其特征在于:采用离子螯合的方式去除阮藻酸钠的步骤为:将质量浓度为2%wt明胶煮沸,加入NaCl使其质量浓度为0.9%wt、加入CaCl2使其摩尔质量浓度为10mmol/L,煮沸2分钟后,放置冰箱中8h后,将上述混合物事先涂覆在装载打印物的培养皿上;在阮藻酸钠中掺入乙二胺四乙酸,挤出在铺有上述混合物的培养皿上;乙二胺四乙酸和Ca2+发生螯合作用,阮藻酸钠降解。

7.如权利要求1所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法,其特征在于:步5

骤(d2)中,细胞浓度为5×10个/mL。

8.如权利要求1所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法,其特征在于:步骤(d2)中,旋转的条件是:温度37℃,转速10rph,旋转30min。

9.如权利要求1所述的基于3D生物打印技术制备组织工程血管的方法,其特征在于:步2

骤(d3)中,体外培养的条件是:施以6.8dynes/cm的壁面剪切应力,37℃恒温。