1.一种用番茄基因和丹参內源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法，由下述步骤组成：

(1)番茄prosystemin基因克隆

TM

用E.Z.N.A. Plant RNA Kit提取试剂盒，按照说明书分离提取番茄总RNA，用PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒，按照说明书将番茄总RNA反转录成cDNA备用；

采用Primer Premier5.0软件，设计番茄prosystemin基因编码框的上游引物、下游引物，以番茄cDNA为模板，进行聚合酶链式反应，反应体系为：取番茄cDNA与DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液、dNTP、上游引物、下游引物、二次蒸馏水的体积比为1：0.5：5：5：1：1：37.5，按照如下条件反应：95℃3分钟，95℃30秒、57℃30秒、72℃45秒、循环35次，得到番茄prosystemin基因，并在番茄prosystemin基因的上游引物前引入Spe I限制性酶切位点和保护碱基GACTAGT，在下游引物前引入BstE II限制性酶切位点和保护碱基CAGGGTAACC，用番茄prosystemin基因引物：上游引物prosystemin-F5′-GACTAGTATGGGAACTCCTTCATATGATATC-3′

下游引物prosystemin-R5′-CAGGGTAACCCGTTTGTCTGTTATTATTTGAG-3′

以番茄cDNA为模板，按下述反应体系进行混合：番茄cDNA与DNA聚合酶、DNA聚合酶缓冲液、dNTP、prosystemin-F、prosystemin-R、二次蒸馏水的体积比为2：0.5：5：

5：1：1：36.5，并按照95℃3分钟，95℃30秒、57℃30秒、72℃45秒、循环35次，进行聚合酶链式反应扩增，得含有酶切位点的番茄prosystemin基因，获得的扩增产物进行电泳分离，回收扩增产物与pMD19-T载体用T4DNA连接酶按连接酶使用说明书连接，构成prosystemin-pMD19-T载体，并采用热激转化法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，prosystemin-pMD19-T载体与大肠杆菌DH5α的体积比为1：9.5～10.5，挑选所得阳性克隆，经菌落聚合酶链式反应检测、测序验证得到番茄prosystemin基因序列，该基因序列如下：(2)构建含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体

用Spe I和BstE II分别 双酶切prosystemin-pMD19-T载 体、植物 表达载 体pCAMBIA-1302，分别回收prosystemin基因片段和pCAMBIA-1302双酶切后的酶切产物，将片段与产物用T4DNA连接酶连接，筛选，获得pCAMBIA-1302-prosystemin中间载体；

选取位于丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因，简称COMT，编码区3′端345bp的片段作为RNA干涉的靶片段，在该片段分别引入酶切位点Cla I/Kpn I及Xho I/BamH I，应用Primer Prime5.0设计扩增引物：iCOMT-F：5′-CCATCGAT GGTACCACCCTCCCCGACGGCGGCGTCCA-3′

iCOMT-R：5′-GCTCTAGACTCGAG GGATCCCACACCACCTACAACCACCTCCT-3′；

用聚合酶链式扩增反应，将该345bp的上游引入Cla I和Kpn I两个酶切位点，于其下游引入Xho I和BamH I两个酶切位点；经聚合酶链式扩增反应扩增，得含有Cla I/Kpn I及Xho I/BamH I的产物COMTi，连接p-MD19T载体得COMTi-pMD19T载体；用Xho I和Kpn I分别酶切COMTi-pMD19T载体、pKannibal载体，将用Xho I、KpnI酶切COMTi-pMD19T载体的片段与经Xho I、Kpn I酶切pKannibal载体的片段，用DNA连接酶相连成pKannibal+中间载体；用BamH I和Cla I分别酶切COMTi-pMD19T载体、pKannibal+载体，用含有BamH I和Cla I酶切COMTi-pMD19T载体的片段与经BamH I和Cla I酶切pKannibal+的片段用DNA连接酶相连，获得的新载体为pKANNIBAL/COMTi；

用Sac I和Pst I双酶切pKANNIBAL/COMTi、pCAMBIA1302-prosystemin载体，将双酶切pKANNIBAL/COMTi所获得的干涉转录框，连接到经双酶切后的pCAMBIA1302-prosystemin载体上，得pCAMBIA1302/prosystemin+pKANNIBAL/COMTi载体，并转入大肠杆菌DH5α中进行扩增，提取质粒，用酶切方法进行鉴定，得到含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体pCAMBIA1302/prosystemin+pKANNIBAL/COMTi，命名为pCPKC载体；

(3)制备含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的根癌农杆菌菌株

将pCPKC载体转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，采用液氮冻融法进行转化，转化后的产物于27.5℃～28.5℃培养箱中倒置培养36～72小时，挑取抗性单菌落分别用prosystemin基因特异性引物prosystemin-F和prosystemin基因特异性引物prosystemin-R进行聚合酶链式反应，筛选，用pCPKC载体上特异性引物，序列为：

35S-F5′-TACAAAGGCGGCAACAAACG-3′

35S-R5′-GCAATGGAATCCGAGGAGGT-3′

进行聚合酶链式反应，筛选，获得含有pCPKC载体的根癌农杆菌菌株；

(4)制备转基因丹参植株

采用常规组织培养方法获得无菌丹参试管苗，采用叶盘转化法，将含有pCPKC载体的根癌农杆菌与无菌丹参试管苗进行浸染，获得含有番茄prosystemin基因并且干涉丹参内源咖啡酰-O-甲基转移酶基因的丹参植株。

2.根据权利要求1所述的用番茄基因和丹参內源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法，其特征在于在本发明的构建含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的步骤(2)中，所述的用Spe I和BstE II双酶切prosystemin-pMD19-T载体、植物表达载体pCAMBIA-1302为：取含有prosystemin-pMD19-T载体、10×M Buffer、限制性内切酶Spe I、限制性内切酶BstE II、二次蒸馏水于37℃反应2小时20分钟，限制性内切酶Spe I与限制性内切酶BstE II、10×M Buffer、含有prosystemin-pMD19-T载体、二次蒸馏水的体积比为1：1：2：6：10；取植物表达载体pCAMBIA-1302、10×M Buffer、限制性内切酶Spe I、限制性内切酶BstE II、二次蒸馏水于

37℃反应3小时，限制性内切酶Spe I与限制性内切酶BstE II、10×M Buffer、植物表达载体pCAMBIA-1302、二次蒸馏水的体积比为1：1：2：6：10。

3.根据权利要求1所述的用番茄基因和丹参內源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法，其特征在于在本发明的构建含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的步骤(2)中，所述的用Xho I和Kpn I分别酶切COMTi-pMD19T载体、pKannibal载体为：取COMTi-pMD19-T载体、10×M Buffer、限制性内切酶Xho I、限制性内切酶Kpn I、二次蒸馏水，37℃反应2小时40分钟，限制性内切酶Xho I与限制性内切酶Kpn I、10×M Buffer、COMTi-pMD19-T载体、二次蒸馏水的体积比为1：1：2：

6：10；取pKannibal载体、10×M Buffer、限制性内切酶Xho I、限制性内切酶Kpn I、二次蒸馏水，37℃反应2小时40分钟，限制性内切酶Xho I与限制性内切酶Kpn I、10×M Buffer、pKannibal载体、二次蒸馏水的体积比为1：1：2：6：10。

4.根据权利要求1所述的用番茄基因和丹参內源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法，其特征在于在本发明的构建含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的步骤(2)中，所述的用BamH I和Cla I分别酶切COMTi-pMD19T载体、pKannibal+载体为：取含有COMTi-pMD19T载体、10×K Buffer、限制性内切酶Cla I、限制性内切酶BamH I、二次蒸馏水，37℃反应2小时30分钟，限制性内切酶Cla I与限制性内切酶BamH I、10×K Buffer、COMTi-pMD19-T载体、二次蒸馏水的体积比为

1：1：2：6：10；取pKannibal+载体、10×K Buffer、限制性内切酶Cla I、限制性内切酶BamH I、二次蒸馏水，37℃反应2小时30分钟，限制性内切酶Cla I与限制性内切酶BamH I、10×K Buffer、pKannibal+载体、二次蒸馏水的体积比为1：1：2：6：10。

5.根据权利要求1所述的用番茄基因和丹参內源基因提高丹参抗虫和活性成分的方法，其特征在于在本发明的构建含有番茄prosystemin基因和丹参咖啡酰-O-甲基转移酶基因干涉片段的植物表达载体的步骤(2)中，所述的用Sac I和Pst I双酶切pKANNIBAL/COMTi、pCAMBIA1302-prosystemin载体为：取pKANNIBAL/COMTi载体、10×M Buffer、限制性内切酶Sac I、限制性内切酶Pst I、二次蒸馏水，37℃反应3小时，限制性内切酶Sac I、限制性内切酶Pst I、10×M Buffer、pKANNIBAL/COMTi载体、二次蒸馏水的体积比为1：1：2：

6：10；取pCAMBIA-1302-prosystemin载体、10×M Buffer、限制性内切酶Sac I、限制性内切酶Pst I、二次蒸馏水于37℃反应3小时，限制性内切酶Sac I与限制性内切酶Pst I、10×M Buffer、pCAMBIA1302-prosystemin载体、二次蒸馏水的体积比为1：1：2：6：10。